牛超数排卵的研究进展

    张艳玲

    摘要：就牛超数排卵应用中常用的激素及改进超数排卵的措施进行综述，以提供简化有效的方法，为牛的超排和胚胎移植提供有价值的参考。

    關键词：牛；超数排卵；雌二醇；卵泡消融

    中图分类号：S857.2+1；S823 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）01-0012-03

    超数排卵、人工授精、胚胎移植等繁殖生物技术广泛用于改善各种家畜的生产特性[1，2]。超数排卵技术是目前应用比较广泛的一种技术，其目的是尽可能的诱导胚胎移植或者使怀胎数量达到最大。虽然有报导称超数排卵可以采取很多方式获取卵母细胞，已经在不同品种的动物中广泛使用并且可以得到可观的胚胎数量[3]，但仍然存在许多问题。牛群体双胎遗传率和排卵遗传力低，分别为0.03和0.07[4]。因此，如何提高母牛的繁殖性能一直是研究的焦点。事实上，超数排卵技术已经成为利用胚胎移植得到大量优良基因的一个重要手段。近期已在卵巢生理学、卵巢功能和促性腺激素的研究上取得了相当大的进展，但是超排卵反应的不可预测性仍然是影响繁殖效率和胚胎移植一个重要问题。

    1 牛的超数排卵

    牛超数排卵旨在不损害供体与卵母细胞成熟、排卵、受精、胚胎发育相关过程情况下，对供体进行处理，以增加排卵率及可用胚胎数。雌性哺乳动物的卵巢中只有一小部分卵母细胞可以排卵。排卵在发情后开始，妊娠期间终止。在这期间，牛由于妊娠和哺乳期的压力，生产期相对较短，每年排卵数可能低至4～5[5]，一头奶牛最理想的状态是每年生产一头小牛。由于卵巢对性腺激素的反应因动物种类不同而有较大差异，且同一种动物种类中个体间差异极大，因而发育的卵泡数、排卵数及受精率等也不尽一致[6]，人们期望通过超排的方式在一个卵泡波中发育出更多的生长卵泡，尽可能排卵整齐，提高受精率和增加可用的胚胎数，从而达到提高超排效率和经济效益的目的。但在超排后，有15%～20%的供体牛产生的胚胎不能用于移植[7]。这主要是因为注射的外源促性腺激素影响着卵母细胞的成熟、受精以及早期胚胎在输卵管和子宫内的发育。

    2 超数排卵中常用的激素

    2.1 马绒毛膜促性腺激素

    羊、马、牛和猪垂体前叶抑制剂的使用早有研究，报道[2]称马绒毛膜促性腺激素（eCG）的使用已经成为标准方法。Betteridge[8]的研究表明，马绒毛膜促性腺激素用于牛胚胎移植早已达成普遍的共识，马绒毛膜促性腺激素必须从黄体卵泡过渡期间给予到受体动物体内，在发情周期过程中约第16天时，动物黄体自然溶解。Hafez等[9]试验结果表明，应用最广泛的是发情周期第16天时给予供体牛2 000～3 000 U的马绒毛膜促性腺激素，其次是在第19天和第20天的时候给予10 mg 17 β-雌二醇或者在第21天给予2 000 U绒毛膜促性腺激素。给予这些激素的目的是要确保黄体溶解，更重要的原因是让大多数供体表现出发情现象[2]，这是超数排卵的早期标准方法。早在19世纪70年代前列腺素商业制剂已经被应用于超数排卵试验上。Elsden等[10]表示，在马绒毛膜促性腺激素处理48 h后，应用前列腺素后超数排卵率比在第16天时给予马绒毛膜促性腺激素高。前列腺素的使用意味着在发情周期的其他时间也有可能引发促性腺激素作用。事实上，Phillippo等[11]认为8～12 d时给予马绒毛膜促性腺激素，与在发情周期的其他时间给予马绒毛膜促性腺激素相比有更高效的超排反应，之后有研究表明这可能与接近次级卵泡波出现的时间有关[12]。

    2.2 雌二醇和孕激素

    选择性地诱导卵泡波出现可以不考虑发情周期就开始超排卵周期，且不需要检测发情，只需在8～12 d开始时给予促性腺激素[13]。在20世纪90年代，研究表明孕激素和雌二醇可以诱导一个新的卵泡波同步出现[14]；使用这种方法进行母牛排卵诱导已经有了广泛的报道[13，15]。使超排卵周期同步出现新的卵泡波最常用的方法给予2.5～5.0 mg 17β-雌二醇或者2.5 mg苯甲酸雌二醇加100或50 mg孕激素，通常使用肌肉注射[14，15]。采用雌二醇处理后的母牛抑制了促卵泡素的释放，导致卵泡闭锁。平均处理4 d后，雌二醇被代谢，一个新的卵泡波出现[14]。即促性腺激素在雌二醇处理4 d后起作用。这种方法可以同时生长一个全新的3～5 mm的卵泡。虽然可移植胚胎数并不总是大于奶牛发情后8～12天超排卵数，但是给予供体母牛雌二醇和孕激素后超排卵的受精率明显高于对照组中的奶牛[14，16]。此外，在没有应用雌二醇而应用孕激素之后，母牛超排卵4 d，得到受精卵和可移植胚胎的百分比与在孕激素注入时用雌二醇处理的情况下相比较低。这些结果表明，外源性卵泡刺激素的应用不仅可诱导卵泡健康成长而且对于那些已经处于闭锁状态的卵泡同样有作用。雌二醇和孕激素的作用引起了一个新的卵泡波的发展方向，再使用促性腺激素处理时得到一种比较均一的具有成熟卵母细胞的卵泡。

    2.3 促性腺激素释放激素

    促性腺激素释放激素刺激下丘脑，使垂体前叶合成和释放促性腺激素。有研究表明促性腺激素释放激素诱导排卵后，处理1.5～2.0 d后一个新的卵泡波将出现。卵泡波出现时才会发生促性腺激素释放激素诱导排卵[17]。促性腺激素释放激素在发情周期的任意阶段应用，可以使44%～55%的奶牛[17]、60%的肉母牛排卵[18]。因此，使用激素产生的卵泡波间隔可能是由于超排卵周期不一致。Deyo等[19]表明使用促性腺激素释放激素产生卵泡波同步之后产生质量差的胚胎，然而研究人员以411头奶牛为试验对象，在发情周期的任意阶段给予孕激素，而后2或3 d给予促性腺激素释放激素具有很好的效果[20]。目前还没有研究采用超声检查的方法检测已经给予供体孕激素后2或3 d给予促性腺激素释放激素排卵和产生同步卵泡波的效率。排卵反应（和卵泡波产生同步）可能是由于孕激素的存在阻止成熟卵泡排卵数增加，因此需要提高促性腺激素释放激素的有效性。

    2.4 卵泡刺激素

    卵泡刺激素（FSH）是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，主要促进卵泡的发育，外源方式注射卵泡刺激素是目前促进母牛超数排卵的一种常见手段，研究表明在母牛发情后的8～12 d，利用递减法或者衡量法注射卵泡刺激素，在第2天或者第3天配合前列腺素或类似物1～2次，在母牛站立后12 h输入精液，之后8～12 h进行第二次输精，在发情的第7天回收胚胎具有良好的效果[14]。利用不同来源促卵泡素注入牛体内，分析对47头复州牛超数排卵效果的影响，研究发现FSH的最适宜剂量为8.8 mg/头，取得对复州牛最优超排方案[21]。纯种和牛超排研究中FHS的最佳制剂为200 mg/头，可用胚胎数达6.5以上。说明不同类型牛中FHS剂量对超排有较大影响，且不同类型牛FHS剂量差异较大，但都具有良好效果。在和牛超排研究中还发现不同季节对和牛超排没有显著影响，但是为了提高效率，可以考虑在夏季超数排卵，利用外源FSH耐受增强供体牛并积极进行子宫治疗，能够有效提高和牛供体利用率[22]。外源FSH对和牛超排影响起到最为关键的作用。

    2.5 其他激素

    目前牛超数排卵常见的方法还有抑制素法、孕酮栓配合促性腺激素释放激素法、DFR，除去优势卵泡后超排法以及在传统方法基础上在第1次输精时通过皮下注射牛生长激素来提高受精率和早期胚胎发育的方法等[23]。

    3 改进超排反应的措施

    3.1 卵泡消融技术

    人们借助超声波扫描技术获得发情周期卵泡波，并在此基础上采用各种方法改进超排反应。另一种方法是利用超声引导对优势卵泡的抑制作用从而使卵泡消融。最初的研究将所有大于5 mm[24]的卵泡消融，但后来发现，只有两大卵泡经过处理后才能确保优势卵泡被消融[25]。1～2 d后启动超刺激处理，这是卵泡波出现的新时间，已经证明消融是非常有效的，但在实际应用中有一定难度。

    3.2 优势供体牛的选择

    影响超数排卵效果因素很多，比如供体牛的品种、营养状况、年龄、胎次、卵巢功能。相关研究报道表明，超数排卵首选3～6岁的高产母牛为佳[26]；在发情或排卵10～12 d进行超排；输精次数一般2次。丁红等[27]的试验表明，年轻母羊对激素反应的敏感性强于老龄母羊，因此选3～4歲母羊作供体为宜，5岁以上母羊超排效果趋于下降，牛也如此，有报道表明2～6的母牛效果最好。供体牛的营养情况也是影响超排反应的一种重要因素，因为营养状态优良的供体牛，其卵巢功能好，排卵多，而营养状态较差的牛排卵较少影响超排反应。Prakash等[28]研究表明，供体体况对于超排反应具有重要的影响，体况差的牛导致并加剧黄体的早期退化（发情后6～8 h），严重影响超排效果，退化严重时，甚至无法得到胚胎。朱玉林[29]认为，超排时母牛处于增重状态，膘情较瘦的牛不影响超排效果。

    3.3 其他增进超排反应的措施

    很多其他因素也会影响超排反应，研究表明季节和环境的变化会显著影响超排效果。即使在同一季节，气候条件、营养水平不同，动物的感受刺激也不尽相同，它们影响动物的超排效果。一般的说，严寒、酷热均会使家畜发生应激反应，这些极端刺激对生理的不良影响会作用于生殖内分泌腺，继而影响到发情和排卵。张俊功等[30]研究表明冬季超排获得胚胎数高于春秋两季。在超排技术方面，包括超排程序的制定与实施，超排时间、人工授精适期的选择以及胚胎回收技术水平等都会影响评价超排效果。由于技术人员操作方法、熟练程度及所用器具存在较大的差别，胚胎回收率高低不一。因此，有必要客观改进诸影响因素以提高牛超排反应的效果。

    4 小结

    随着胚胎移植技术的发展，超数排卵技术显得尤为重要。超排的应用能够加速品种的改良，保护稀有物种，提高繁殖效率，具有十分重要的研究意义。但是影响牛超排的因素较多并且复杂，如何获得人们所期望的理想效果是目前研究的重要问题。根据实际需要，运用科研手段不断的研究和进一步优化超排程序、提高可用胚数等仍然是今后努力的方向。

    参考文献：

    [1] SEIDEL G E J，SEIDEL S M.Training Manual for Embryo TRansfer in Cattle[M].Fort Collins：Food and Agriculture Organization of the United Nations，1991.168.

    [2] MISRA A K，SHIV P，TANEJA V K. Embryo transfer technology （ETT） in cattle and buffalo in India：A review[J].The Indian J Anim Sci，2005，75：7.

    [3] ARMSTRONG D.Recent advances in superovulation of cattle[J].Theriogenology，1993，39：7–24.

    [4] GREGORY K E，ECHTERNKAMP S E，DICHERSON G E，et al. Twinning incattle：Foundation animals and genetic and environment effects ontwining rate[J].J Anim Sci，1990，68（7）：1867-1876.

    [5] CROWE M A，DISKIN M G，WILLIAMS E J. Parturition to resumption of ovarian cyclicity：Comparative aspects of beef and dairy cows[J].Animal An International Journal of Animal Bioscience，2014（S1）：40-53.

    [6] 森纯一，金川宏司，浜名克己.兽医繁殖学[M].第二版.东京：文永堂出版株式会社，2003.

    [7] FOOTE R H，ELLINGTOLL J E. Is a superovulated oocyte normal[J].Theriogenology，1988，29：111-117.

    [8] BETTERIDGE K J. Techniques and results in cattle：superovulation[M].Canada：Canada Department of Agriculture，1977.

    [9] HAFEZ E S，SUGIE T，HUNT W L. Superovulation and related phenomena in the beef cow：effect of oestrogen administration on production ofova[J].J Reprod Fertil，1963，5：381–388.

    [10] ELSDEN R P，LEWIS S，CUMMING I A，et al. Superovulation in the cow following treatment with PMSG and prostaglandin F2[J].J Reprod Fertil，1974，36：455–456.

    [11] PHILLIPPO M，ROWSON L E A. Prostaglandins and superovulation in the bovine[J].Ann Biol Anim Biochim Biophys，1975，15：233-240.

    [12] GINTHER O J，KNOPF L，KASTELIC J P. Temporal associations amongovarian events in cattle during oestrous cycles with two and three follicular waves[J]. JReprod Fertil，1989，87：223-230.

    [13] MAPLETOFT R J，BENNETT-STEWARD K，ADAMS G P. Recent advances in the superovulation of cattle[J].Reprod Nutr Dev，2002，42：601-611.

    [14] B？魷 G A，ADAMS G P，PIERSON R A，et al. Exogenous controlof follicular wave emergence in cattle[J].Theriogenology，1995，43：31-40.

    [15] B？魷 G A，BARUSELLI P S，MORENO D，et al.The control of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs in cattle[J].Theriogenology，2002，57：53-72.

    [16] B？魷 G A，PIERSON R A，MAPLETOFT R J. The effect of estradiol valerate onfollicular dynamics and superovulatory response in cows with Syncro-Mate-B implants[J].Theriogenology 1991，36（2）：169–183.

    [17] MARTINEZ M F，ADAMS G P，BERGFELT D，et al. Effectof LH or GnRH on the dominant follicle of the rst follicular wave inheifers[J].Anim Reprod Sci，1999，57：23-33.

    [18] COLAZO M G，GORDON M B，RAJAMAHENDRAN R，et al. Pregnancy rates to timed arti cial insemination indairy cows treated with gonadotropin-releasing hormone orporcine luteinizing hormone[J].Theriogenology，2009，72：262-70.

    [19] DEYO C D，COLAZO M G，MARTINEZ M F，et al. The use of GnRH or LH to synchronize follicular wave emergence for superstimulationin cattle[J]. Theriogenology，2001，55：513.

    [20] STEEL R，HASLER J. Comparison of three different protocols for superstimulation of dairy cattle[J].Reprod Fertil Dev，2009，21：246.

    [21] 朱芳賢，刘丑生，王志刚，等.复州牛超数排卵效果研究[J].中国畜牧兽医，2015，42（3）：668-675.

    [22] 郝海生，陈 余，郭江鹏，等.和牛超数排卵影响因素的研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（12）：204-208.

    [23] MOREIRA F，BANDINGA L，BURNLEY C. Bovine somatotropin increases embryonic development in superovulated cows and improves posttransfer pregnancy rates when given to lactation recipient cows[J].Theriogenology，2002，57：1371-1387.

    [24] BERGFELT D R，B？魷 G A，MAPLETOFT R J，et al. Superovulatory response following ablation-induced follicular wave emergence at random stages of the estrous cycle in cattle[J].Anim Reprod Sci，1997，49：1-12.

    [25] BARACALDO M I，MARTINEZ M，ADAMS G P，et al. Superovulatory response following transvaginal follicle ablation in cattle[J].Theriogenology，2000，53：1239-1250.

    [26] 武浩楠，郑 鹏，黄 贺，等.影响奶牛超数排卵和胚胎移植的因素[J].黑龙江动物繁殖，2014（1）：48-49.

    [27] 丁 红，玛依拉.促卵泡素和年龄对绵羊超数排卵效果的影响[J].中国畜牧杂志，1998，34（3）：18-20.

    [28] PRAKASH B S，SINQLA S K，AMBROSE J D，et al. Assessment of superovulatoryresponses in terms of palpable corpora lutea and embryorecovery usingmilk progesterone[J].Theriogenology，1992，37：897-905.

    [29] 朱玉林.改善奶牛超数排卵效果的方法[J].中国奶牛，1994，12（4）：31-33.

    [30] 张俊功，谭秀文.季节和激素剂量对鲁西黄牛超数排卵的影响[J].中国牛业科学，2006，32（1）：32-37.