粉葛多糖制备工艺研究
何美军+陈沫+王华+穆森+郭坤元+黄东海+张宇
摘要：以粉葛为原料，采用单因子及正交试验的方法，研究制备粉葛多糖的主要工艺条件（复合酶的量，pH值，温度，时间）。结果表明，粉葛多糖制的工艺条件为：复合酶的量为016%，温度30℃，时间100min，pH值为60，这4个因素对于粉葛多糖作用的大小依次为：复合酶量>温度>时间>pH值。水解溶液中粉葛多糖含量为894mg/100ml。
关键词：粉葛；多糖；复合酶
中图分类号：TS244文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0038-03StudyonthePreparationofKudzuPolysaccharideHeMeijunChenMoWangHuaMuSenGuoKunyuanHuangDonghaiZhangYu
（InstituteoftraditionalChinesemedicine，HubeiAcademyofAgriculturalSciencesEnshi445000）
Abstract：Takingkudzuasrawmaterial，usingthemethodofsinglefactorandorthogonaltest，themainprocessconditionsofpreparationofkudzupolysaccharide（enzymeamount，pHvalue，temperature，time）.Theresultsshowthattheprocessconditionsofkudzupolysaccharideswereasfollows：compositeenzymeamountwas0.16%，temperature30，time100min，pHvalueis6，thesizeofthe4factorsfortheeffectofPuerariapolysaccharidewere：compositeenzymedosage>temperature>time>pH.Thecontentofpolysaccharideinhydrolyzedsolutionwas894mg/100ml.
Keywords：PuerariathomsoniiBenth；polysaccharide；compositeenzyme
粉葛是豆科植物葛的变种甘葛藤（PuerariathomsoniiBenth）的干燥根[1]，是药食同源植物，因其含有较高含量的葛根淀粉及葛根黄酮类化合物[2-6]，如今已经广泛的用作粮食、蔬菜、功能食品等原料[7-8]。粉葛的综合加工研究较多[9-10]，如粉葛淀粉、葛根素、葛根总黄酮等的提取。而粉葛多糖的提取分离研究报道较少。本研究的粉葛多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，局部分子结构上连结有少数黄酮母环结构，从分子结构来看，在粉葛的化学成分中，粉葛多糖为一大类功能化合物质，有较好的应有前景，本研究旨在提高粉葛的经济性状和加工利用率，为进一步开发粉葛功能产品奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料与试剂
试验用粉葛于2016年10月采自恩施市三岔粉葛基地。试剂：苯酚（分析纯），葡萄糖（食用级），纯净水，浓硫酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯），三氯乙酸（分析纯），盐酸（分析纯）。
1.1.2仪器
紫外可见分光光度计（UV-1800型，上海仪田精密仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-201型，上海一科仪器有限公司）；真空干燥箱（DZF型，北京永光明医疗仪器厂）；粉碎机（自贡市机械厂）。
1.2方法
采用单因子及正交试验的方法，研究制备粉葛多糖的主要工艺条件（复合酶的量，水解pH值，温度，时间）。取新鲜粉葛根，除杂洗净，沥干，切碎，打浆，放入高压灭菌锅中，加入葛根重量8倍的去离子水，加压至6MPa进行高压处理100min，卸压，冷却至室温，再向浆液中加入原葛根重量4倍的去离子无菌水制备粉葛多糖，通过控制不同的因素（复合酶的量，水解PH值，温度，时间），研究适宜多糖制备的最佳工艺。每组处理匀采用了3次重复，求3次平均值。
1.2.1单因子实验
（1）复合酶的量。加入原葛根重量010%，012%，014%，016%，018%，020%，022%的复合酶（纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的混合物），考察复合酶加入量对水解液中多糖含量的影响。
（2）温度。分别选取温度分别为20，25，30，35，40，45℃进行试验。考察不同水解时间对水解液中多糖的含量的影响。
（3）时间。水解在60，70，80，90，100，110，120min进行试验。考察不同PH值对水解液中多糖的含量的影响。
（4）pH的确定。调节pH为20，30，40，50，60，70。考察不同PH值对水解液中多糖的含量的影响。
湖北林业科技第46卷第6期何美军，等：粉葛多糖制备工艺研究1.2.2正交试验
分别以复合酶占原粉葛质量的百分数、水解温度、水解时间、水解的pH值为4因素，粉葛总多糖的含量为指标设计L9（34）四因素三水平正交试验（因素与水平见表1），进一步优化粉葛多糖提取的最优工艺参数。
1.2.3檢测方法
粉葛中多糖的检测，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，以葡萄糖作为标准，于490nm测定标准物质量浓度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。倒上清液于10mL离心管中，再加少许5%TCA溶液，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。离心转速3000转/min，共三次。第一次15min，取上清液。后两次各5min取上清液到25mL锥形比色管中。最后滤液保持18mL左右。在向比色管中加入6mol/L盐酸2mL之后摇匀，在90℃水浴锅中水浴2h。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。定容至25mL的容量瓶中。吸取02mL的样品液，以蒸馏补至20mL，然后加入6%苯酚10mL及浓硫酸5.0mL，摇匀冷却室温放置20min以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。
1.2.4数据处理
采用SPSS19.0数据处理软件对正交试验结果进行分析，并对正交试验结果进行直观分析。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
（1）复合酶的量。加入原葛根重量010%，012%，014%，016%，018%，020%，022%的复合酶（同上），水解温度30℃，水解时间120min，调节pH为60时，考察复合酶加入量对水解液中多糖含量的影响（表2）。由表2可知，不同复合酶的量水解溶液中多糖的含量差异显著，加入原葛根重量016%时，水解液中多糖的含量最高。
（2）温度。不同水解温度对多糖含量的影响（见表3）。加入原葛根重量016%的复合酶，水解时间120min，水解PH值为60时，由表3可知，水解温度30℃时，水解溶液中的多糖含量最高。
（3）时间。不同水解时间对多糖含量的影响见表4。由表4可知，加入原葛根重量016%复合酶，水解温度30℃，水解pH值为60，水解时间为100min时，水解溶液中的多糖含量最高。
（4）pH值。不同pH值对水解溶液中多糖含量的影响见表5。由表5可知，加入原葛根重量016%复合酶，水解温度30℃，水解时间为100min，水解pH值为60时，水解溶液中的多糖含量最高。
2.2正交试验结果
分别以加入复合酶的量，水解温度、水解时间、水解pH值为4因素，溶液中多糖的含量为指标设计L9（34）四因素三水平正交试验，进一步优化复合酶提取粉葛多糖的最优工艺参数。由表6可以看到，4个因素对粉葛多糖的含量影响均极为显著，但其影响程度高的大小有较大差异，采用正交试验对水解条件进行优化，结果表明，粉葛多糖含量高的工艺条件为A3B2C3D3，即为复合酶的量为016%，水解温度30℃，水解时间100min，pH值为60。方差分析结果见表7，由表7可以看出，正交模型的方差分析显著，模型R2=0991表明该正交模型能够很好的模拟试验。复合酶的量，水解温度、水解时间、水解pH值对粉葛多糖的含量的影响均达到极显著（P<001）。
3结论
本研究的粉葛多糖制备工艺参数是复合酶的量为016%，水解温度30℃，水解时间100min，pH值为60。这4个因素对于粉葛多糖含量作用的大小依次为：A>B>C>D，即复合酶量>水解温度>水解时间>pH值。该工艺简单易操作，绿色无污染。在工业化生产中，会因为设备大小及性能变化而变化。粉葛多糖为一大类功能化合物质，有较好的应有前景，本研究旨在提高粉葛的经济性状和加工利用率，为进一步开发葛根功能产品奠定基础。
参考文献
[1]许国钧.中草药彩色图谱[M].福州：福建科学技术出版社，1990.
[2]蔡宝昌，刘训江.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
[3]周国海，于华忠，李国章，等.葛根中总黄酮及葛根素的含量测定[J].湖南林业科技，2004，31（5）：7172.
[4]JiangRW，LauKM，LamHM，etal.AcomparativestudyonaqueousrootextractsofPuerariathomsoniiandPuerarialobatabyantioxidantassayandHPLCfingerprintanalysis[J].JournalofEthnopharmacology，2005，96（1/2）：133138.
[5]AraKirakosyan，PeterBK，SaraWarber，etal.QuantificationofmajorisoflavonoidsandLcanavanineinseveralorgansofkudzuvine（Puerariamontana）andinstarchSamplesderivedfromkudzuroots[J].PlantScience，2003，164：883888.
[6]AdamMatkowski.InvitroisoflavonoidproductionincallusfromdifferentorgansofPuerarialobata（Wild.）Ohwi[J].PlantPhysiol，2004，161（3）：343346.
[7]秦丹，譚兴和，林亲录.葛根采后生理研究[J].保鲜与加工，2005，5（1）：2628.
[8]王美东，李常行，孙钦美.葛根提取工艺的正交设计试验[J].齐鲁事，2005，24（1）：4546.
[9]李玉山.葛根的综合开发与利用[J].林产化学与工业，2009，29（6）：109115.
[10]施英英，薛培俭，夏黎明.酶法提取葛根渣中异黄酮的研究[J].林产化学与工业，2006，26（1）：6264.
（责任编辑：夏剑萍）
摘要：以粉葛为原料，采用单因子及正交试验的方法，研究制备粉葛多糖的主要工艺条件（复合酶的量，pH值，温度，时间）。结果表明，粉葛多糖制的工艺条件为：复合酶的量为016%，温度30℃，时间100min，pH值为60，这4个因素对于粉葛多糖作用的大小依次为：复合酶量>温度>时间>pH值。水解溶液中粉葛多糖含量为894mg/100ml。
关键词：粉葛；多糖；复合酶
中图分类号：TS244文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0038-03StudyonthePreparationofKudzuPolysaccharideHeMeijunChenMoWangHuaMuSenGuoKunyuanHuangDonghaiZhangYu
（InstituteoftraditionalChinesemedicine，HubeiAcademyofAgriculturalSciencesEnshi445000）
Abstract：Takingkudzuasrawmaterial，usingthemethodofsinglefactorandorthogonaltest，themainprocessconditionsofpreparationofkudzupolysaccharide（enzymeamount，pHvalue，temperature，time）.Theresultsshowthattheprocessconditionsofkudzupolysaccharideswereasfollows：compositeenzymeamountwas0.16%，temperature30，time100min，pHvalueis6，thesizeofthe4factorsfortheeffectofPuerariapolysaccharidewere：compositeenzymedosage>temperature>time>pH.Thecontentofpolysaccharideinhydrolyzedsolutionwas894mg/100ml.
Keywords：PuerariathomsoniiBenth；polysaccharide；compositeenzyme
粉葛是豆科植物葛的变种甘葛藤（PuerariathomsoniiBenth）的干燥根[1]，是药食同源植物，因其含有较高含量的葛根淀粉及葛根黄酮类化合物[2-6]，如今已经广泛的用作粮食、蔬菜、功能食品等原料[7-8]。粉葛的综合加工研究较多[9-10]，如粉葛淀粉、葛根素、葛根总黄酮等的提取。而粉葛多糖的提取分离研究报道较少。本研究的粉葛多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，局部分子结构上连结有少数黄酮母环结构，从分子结构来看，在粉葛的化学成分中，粉葛多糖为一大类功能化合物质，有较好的应有前景，本研究旨在提高粉葛的经济性状和加工利用率，为进一步开发粉葛功能产品奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料与试剂
试验用粉葛于2016年10月采自恩施市三岔粉葛基地。试剂：苯酚（分析纯），葡萄糖（食用级），纯净水，浓硫酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯），三氯乙酸（分析纯），盐酸（分析纯）。
1.1.2仪器
紫外可见分光光度计（UV-1800型，上海仪田精密仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-201型，上海一科仪器有限公司）；真空干燥箱（DZF型，北京永光明医疗仪器厂）；粉碎机（自贡市机械厂）。
1.2方法
采用单因子及正交试验的方法，研究制备粉葛多糖的主要工艺条件（复合酶的量，水解pH值，温度，时间）。取新鲜粉葛根，除杂洗净，沥干，切碎，打浆，放入高压灭菌锅中，加入葛根重量8倍的去离子水，加压至6MPa进行高压处理100min，卸压，冷却至室温，再向浆液中加入原葛根重量4倍的去离子无菌水制备粉葛多糖，通过控制不同的因素（复合酶的量，水解PH值，温度，时间），研究适宜多糖制备的最佳工艺。每组处理匀采用了3次重复，求3次平均值。
1.2.1单因子实验
（1）复合酶的量。加入原葛根重量010%，012%，014%，016%，018%，020%，022%的复合酶（纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的混合物），考察复合酶加入量对水解液中多糖含量的影响。
（2）温度。分别选取温度分别为20，25，30，35，40，45℃进行试验。考察不同水解时间对水解液中多糖的含量的影响。
（3）时间。水解在60，70，80，90，100，110，120min进行试验。考察不同PH值对水解液中多糖的含量的影响。
（4）pH的确定。调节pH为20，30，40，50，60，70。考察不同PH值对水解液中多糖的含量的影响。
湖北林业科技第46卷第6期何美军，等：粉葛多糖制备工艺研究1.2.2正交试验
分别以复合酶占原粉葛质量的百分数、水解温度、水解时间、水解的pH值为4因素，粉葛总多糖的含量为指标设计L9（34）四因素三水平正交试验（因素与水平见表1），进一步优化粉葛多糖提取的最优工艺参数。
1.2.3檢测方法
粉葛中多糖的检测，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，以葡萄糖作为标准，于490nm测定标准物质量浓度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。倒上清液于10mL离心管中，再加少许5%TCA溶液，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。离心转速3000转/min，共三次。第一次15min，取上清液。后两次各5min取上清液到25mL锥形比色管中。最后滤液保持18mL左右。在向比色管中加入6mol/L盐酸2mL之后摇匀，在90℃水浴锅中水浴2h。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。定容至25mL的容量瓶中。吸取02mL的样品液，以蒸馏补至20mL，然后加入6%苯酚10mL及浓硫酸5.0mL，摇匀冷却室温放置20min以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。
1.2.4数据处理
采用SPSS19.0数据处理软件对正交试验结果进行分析，并对正交试验结果进行直观分析。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
（1）复合酶的量。加入原葛根重量010%，012%，014%，016%，018%，020%，022%的复合酶（同上），水解温度30℃，水解时间120min，调节pH为60时，考察复合酶加入量对水解液中多糖含量的影响（表2）。由表2可知，不同复合酶的量水解溶液中多糖的含量差异显著，加入原葛根重量016%时，水解液中多糖的含量最高。
（2）温度。不同水解温度对多糖含量的影响（见表3）。加入原葛根重量016%的复合酶，水解时间120min，水解PH值为60时，由表3可知，水解温度30℃时，水解溶液中的多糖含量最高。
（3）时间。不同水解时间对多糖含量的影响见表4。由表4可知，加入原葛根重量016%复合酶，水解温度30℃，水解pH值为60，水解时间为100min时，水解溶液中的多糖含量最高。
（4）pH值。不同pH值对水解溶液中多糖含量的影响见表5。由表5可知，加入原葛根重量016%复合酶，水解温度30℃，水解时间为100min，水解pH值为60时，水解溶液中的多糖含量最高。
2.2正交试验结果
分别以加入复合酶的量，水解温度、水解时间、水解pH值为4因素，溶液中多糖的含量为指标设计L9（34）四因素三水平正交试验，进一步优化复合酶提取粉葛多糖的最优工艺参数。由表6可以看到，4个因素对粉葛多糖的含量影响均极为显著，但其影响程度高的大小有较大差异，采用正交试验对水解条件进行优化，结果表明，粉葛多糖含量高的工艺条件为A3B2C3D3，即为复合酶的量为016%，水解温度30℃，水解时间100min，pH值为60。方差分析结果见表7，由表7可以看出，正交模型的方差分析显著，模型R2=0991表明该正交模型能够很好的模拟试验。复合酶的量，水解温度、水解时间、水解pH值对粉葛多糖的含量的影响均达到极显著（P<001）。
3结论
本研究的粉葛多糖制备工艺参数是复合酶的量为016%，水解温度30℃，水解时间100min，pH值为60。这4个因素对于粉葛多糖含量作用的大小依次为：A>B>C>D，即复合酶量>水解温度>水解时间>pH值。该工艺简单易操作，绿色无污染。在工业化生产中，会因为设备大小及性能变化而变化。粉葛多糖为一大类功能化合物质，有较好的应有前景，本研究旨在提高粉葛的经济性状和加工利用率，为进一步开发葛根功能产品奠定基础。
参考文献
[1]许国钧.中草药彩色图谱[M].福州：福建科学技术出版社，1990.
[2]蔡宝昌，刘训江.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
[3]周国海，于华忠，李国章，等.葛根中总黄酮及葛根素的含量测定[J].湖南林业科技，2004，31（5）：7172.
[4]JiangRW，LauKM，LamHM，etal.AcomparativestudyonaqueousrootextractsofPuerariathomsoniiandPuerarialobatabyantioxidantassayandHPLCfingerprintanalysis[J].JournalofEthnopharmacology，2005，96（1/2）：133138.
[5]AraKirakosyan，PeterBK，SaraWarber，etal.QuantificationofmajorisoflavonoidsandLcanavanineinseveralorgansofkudzuvine（Puerariamontana）andinstarchSamplesderivedfromkudzuroots[J].PlantScience，2003，164：883888.
[6]AdamMatkowski.InvitroisoflavonoidproductionincallusfromdifferentorgansofPuerarialobata（Wild.）Ohwi[J].PlantPhysiol，2004，161（3）：343346.
[7]秦丹，譚兴和，林亲录.葛根采后生理研究[J].保鲜与加工，2005，5（1）：2628.
[8]王美东，李常行，孙钦美.葛根提取工艺的正交设计试验[J].齐鲁事，2005，24（1）：4546.
[9]李玉山.葛根的综合开发与利用[J].林产化学与工业，2009，29（6）：109115.
[10]施英英，薛培俭，夏黎明.酶法提取葛根渣中异黄酮的研究[J].林产化学与工业，2006，26（1）：6264.
（责任编辑：夏剑萍）
