西瓜果实长圆的遗传及候选基因定位

     豆峻岭 赵胜杰 路绪强 何楠 张磊 匡汉晖 刘文革

    目的与意义：果实形状作为一个非常重要的农艺性状，在许多作物中已经有了非常深入的研究，同时也获得了许多控制果实形状的候选基因。随着2012年西瓜全基因组测序的完成，西瓜分子生物学的研究得到了快速发展，目前关于西瓜遗传图谱的报道有很多，根据遗传图谱也得到了许多性状的QTLs，尤其是西瓜果实的长度、宽度、果形指数等。然而目前还没有关于西瓜果实形状候选基因定位的报道。因此笔者通过配制杂交组合，解析西瓜果实形状的遗传模式，同时利用现代分子生物学手段，希望能够获得控制西瓜果实形状的候选基因。

    材料与方法：以长果西瓜自交系‘短125（P1）和圆果西瓜自交系‘郑州籽瓜（P2）为亲本杂交配制F1，F1自交配制F2分离群体，F1分别和P1、P2回交配制回交群体BC1P1、BC1P2。采用BSA（混合群体分离分析）测序法从F2分离群体中分别选取长瓜30株、圆瓜30株，分别采取叶片提取DNA，然后分别将长瓜和圆瓜DNA等量混合，送公司进行全基因组重测序。结合GWAS（全基因组关联分析）分析得到控制西瓜果实形状的候选区间。之后通过分析候选区间内的SNPs，开发出298个CAPS标记，根据这些标记对430株F2分离群体进行酶切检测，筛选重组单株，从而缩小候选区间。最终通过实时荧光定量PCR技术对候选基因在不同发育时期不同组织器官中进行实时荧光定量PCR分析。

    结果与分析：（1）通过对西瓜果实形状六世代群体的遗传分析，西瓜果实长圆为单基因不完全显性遗传，其中果实长为显性纯合（OO），果实圆为隐性纯合（oo），而果实椭圆为杂合（Oo）。同时对两亲本发育过程果形指数进行测定，结果发现，授粉当天果形指数最大，长瓜达到3.15，圆瓜达到1.43。而随着果实的发育，长瓜最终维持在1.83左右，而圆瓜维持在1.02左右。（2）通过BSA和GWAS相结合的方法，西瓜果实形状被定位在3号染色体23.52～28.83 Mb的区间内。进一步通过CAPS标记进行精细定位，最终候选基因被定位到3號染色体26.817～26.863 Mb的区间内（原图4）。比对参考基因组中该区间内的功能基因，最终发现在该区间只有4个功能基因，分别扩增这4个基因，最终发现Cla011257在长瓜中有1个159 bp缺失，而该缺失造成了53个氨基酸缺失。继续比对2个参考基因组中该基因的差异，也发现在‘Charleston Gray（长瓜）参考基因组中有1个159 bp缺失，而在‘97103（圆瓜）参考基因组中则没有该缺失。因此推测Cla011257为控制西瓜果实长圆的候选基因。根据该缺失片段，开发出一个indel标记，将该标记在100份西瓜种质资源中检测发现该标记和西瓜果实形状紧密连锁（原图5）。通过蛋白功能预测发现该基因编码IQD蛋白。（3）将花期的根、茎、叶、花以及不同发育时期的子房、果皮、果肉进行候选基因的实时荧光定量分析，最终发现在授粉当天该基因有最高表达量，这也解释了授粉当天果形指数有最大值的原因，子房的形状也决定了成熟后果实的形状。

    结? ? 论：本研究首先明确了西瓜果实形状的遗传为单基因不完全显性遗传，即纯合显性（OO）为长果，杂合（Oo）为椭圆果，纯合隐性（oo）为圆果。通过BSA测序和GWAS重测序相结合的方法将控制西瓜果实形状的基因定位于3号染色体26.817～26.863 Mb的区域内，通过深入研究，最终确定Cla011257基因在长果西瓜中有1个159 bp缺失，造成了53个氨基酸缺失;而在圆瓜中无该缺失。进一步分析发现该基因为IQD蛋白家族成员。