周期素依赖性蛋白激酶—5在不同成年牛皮肤中的表达

    刘晋冀+杨洁鸿

    

    摘要：采用不同毛色的牛皮作为研究对象，运用免疫组织化学法对周期素依赖性蛋白激酶-5（CDK-5）在成年牛皮肤中的表达进行定位和定性研究。结果表明，CDK-5在牛皮肤毛囊的外根鞘和毛球部呈阳性表达，说明CDK-5可能与牛毛色形成有关。

    关键词：周期素依赖性蛋白激酶-5（CDK-5）；毛囊；毛色；免疫组织化学

    中图分类号：S823；Q344+.13 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）03-0005-02

    周期素依赖性蛋白激酶-5（Cyclin dependent kinase 5，CDK-5）是CDKs家族的成员之一，属于小丝氨酸/苏氨酸激酶家族，因为他具有与其他的CDK成员同源的序列而得名[1]。但CDK-5的功能却不同于其他CDKs成员那样参与细胞周期的调控，而是主要参与神经元正常功能的维持[2]。最初认为CDK-5仅在神经元中表达，但近年的研究发现CDK-5在非神经元的组织或细胞中广泛表达并发挥作用。牛（Cattle）是中国传统物种，也是非常常见的物种之一。牛作为经济型大型哺乳动物，除了肉、奶等畜牧产品外，皮毛作为农业附属品，也同样具有研究价值。动物皮毛中的黑色素种类、数量以及分布情况决定其毛色的表达，其中酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成过程中的关键酶，对毛色形成发挥至关重要的作用。其中酪氨酸羟化酶（TH）是TYR重要的激活因子之一，而TH酶的活性受细胞CDK-5的调控，因此CDK-5可能在毛色形成过程中发挥作用。哺乳动物的毛色受许多基因的控制，这些基因通过相互作用决定毛色的产生。研究CDK-5与牛毛色的关系，不仅会通过实践操作对免疫组化有一个定性的认识，而且可以依据学术界先锋对羊驼的毛色形成的研究作出假设，对CDK-5是否对所有动物的毛色形成有关系这一问题提供一个实例[3-8]。白色毛色是由于黑色素细胞数量较少，黑素体内黑色素含量也少，毛根中明显缺乏黑色素细胞及其前体的缘故[9]。哺乳动物的皮肤和毛发色素沉着决定于其所含真黑色素与褐色素的相对数量[10，11]。因此，试验对CDK-5在黑白两色牛皮肤中的表达进行了研究。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    选取黑白毛色的牛体侧皮肤，剃毛后刮净表皮，用取皮器取出黑白各2块牛皮肤组织，置于4%的中性甲醛溶液中固定18 h，石蜡包埋，切片，进行免疫组织化学研究。

    1.2 主要试剂及方法

    兔抗人、大鼠、小鼠CDK-5多克隆抗体、HRP-山羊抗兔LgG、DAB显色试剂盒（DB公司）；PBS缓冲液，正常兔血清，DAB显色液，Triton试剂（聚乙二醇辛基苯基醚），无水乙醇，苏木精染料，KD-BM生物组织包埋机、KD-2508切片机，HPP-9160电热恒温培养箱、HH-6数显恒温水浴锅、Leica DMLB显微镜。组织包埋及切片制作免疫组织化学流程参照文献[11]的方法。

    1.3 免疫组化图像分析

    光镜下观察免疫组织化学切片，每头牛取3张切片，每张切片用DP软件采集5个视野，对染色结果用Image-ProPlus 6.0软件进行图像分析，进行阴阳性对照。

    2 结果与分析

    免疫组织化学染色结果显示，CDK-5在白色和黑色牛皮肤毛囊的外根鞘和毛球部呈阳性表达，反应阳性物分布在胞质和细胞间质内，对照组未观察到阳性细胞（图1）。由图1可知，在黑白两色牛皮肤毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5阳性免疫反应物，預示了CDK-5在黑白两色牛皮肤毛囊中发挥着某种生物学功能。

    3 讨论

    本研究发现，在黑白牛皮肤毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5阳性免疫反应物，表明CDK-5在黑白两色牛皮肤毛囊中发挥着某种生物学功能。皮肤毛囊外根鞘内含有大量的黑色素细胞，正常的黑色素细胞形态特点为核小和胞浆不明显[12]，而毛球是产生生黑素细胞并直接向毛干输送黑色素的惟一部位[13]。研究发现，CDK-5是一个能使体内外的酪氨酸羟化酶（TH）发生磷酸化的激酶[14]，TH在许多位点被不同的激酶磷酸化后不同程度地影响着TH酶的活性[15-17]。TH被CDK-5磷酸化后，TH的蛋白水平和活性均增加，如果缺少CDK-5，TH蛋白将不稳定，容易发生降解。TH是TYR的活性之一，而TYR是在黑色素合成的起始过程中的一种关键酶。

    本研究结果显示，黑白色牛皮肤中存在CDK-5基因和蛋白的表达量，与文献观点相结合，推测CDK-5与牛毛色的形成相关。然而，CDK-5在牛毛色形成调控过程中的作用和其功能的验证还有待于进一步的研究，本试验将为研究该基因与牛乃至其他哺乳动物毛色形成的关系提供一定的理论基础。

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