基于氮掺杂石墨烯量子点/硫化镉纳米晶电化学发光传感器检测硫化氢

    杜方凯 张慧 谭学才 冯德芬 罗燕妮

    

    

    

    摘?要?以柠檬酸和氨水为原料，用水热法制备了氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs），与硫化镉纳米晶（CdS NCs）复合，构建了固态电化学发光（ECL）传感器，用于硫化氢（H2S）的检测。采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对NGQDs和CdS NCs进行了表征，同时对传感器的ECL和电化学行为进行了系统研究。结果表明，以H2O2为CdS NCs的共反应试剂时，NGQDs可增强CdS NCs的ECL信号，并且NGQDs/CdS NCs的穩定性增加。H2S存在下，S2与过量的Cd2+发生键合作用，ECL值降低。在最优条件下， ECL变化值与H2S浓度（2.0×1010～2.0×105 mol/L）的对数呈良好的线性关系，检出限为6.7×1011 mol/L。采用本传感器测定血清中H2S浓度，加标回收率为92.7%～103.8%。

    关键词?电化学发光;石墨烯量子点;硫化镉纳米簇;硫化氢

    1?引 言

    硫化氢（H2S）是一种无色、易燃、水溶性气体，具有臭鸡蛋的特有气味，传统意义上被认为是有毒气体[1]。然而，最近的研究证明，H2S是一种人类或其它生物体内可以产生的气态信号，除一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）外，H2S被认为是第三种气体信号分子[2]，在心血管系统、中枢神经系统、呼吸系统，胃肠系统以及内分泌系统等方面起着重要的调节作用[3～7]。H2S浓度异常可能导致一些疾病，如胃粘膜损伤、肝硬化和阿尔茨海默氏病[8～10]等。现有的检测H2S的方法有比色法[11]、磷光法[12]、气相色谱法[13]、荧光法[14]和电化学发光法[15]等。其中，电化学发光技术具有仪器较简单、快速、灵敏度高、线性范围宽等优点，引起了广泛关注[16，17]。目前的电化学发光体系中，鲁米诺及三联吡啶钌因水溶性好、发光效率高、稳定性好而成为常用的发光试剂。然而，这些发光试剂价格昂贵、对环境污染大， 制约了电化学发光技术的发展。 因此， 构建价格低廉、易于合成、可固定于电极表面的发光试剂具有重要的意义。

    半导体纳米晶体（NCs）作为一种新型ECL发光试剂，与传统的分子发光试剂相比，具有尺寸/表面陷阱控制发光、抗光漂白稳定性好等优点，但NCs的ECL发光强度通常较低，限制了其广泛应用。纳米材料（如碳纳米管[18]、石墨烯[19]、金纳米粒子[20]、银纳米粒子[21]）与NCs制备复合材料，是提高ECL发光效率的有效途径之一。此外，加入共反应试剂是另一种有效法，如Zhang等[22]报道共反应试剂H2O2可极大地增强CdS NCs的ECL强度。

    氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs）作为新型碳纳米材料，具有良好的生物相容性、优异的细胞膜通透性和理想的光学性能，引起了广泛关注[23，24]。近年来，已开发出具有优异荧光特性的NGQDs用于电化学发光分析传感领域[25，26]，但改善其水溶性、简化改性过程、产生高而稳定的ECL信号仍然是研究的重点。

    本研究将NGQDs与CdS NCs简单混合制备其复合物，修饰于电极表面，显示了较强的ECL强度。样品中存在H2S时，电极的ECL响应强度减弱，基于此建立了检测H2S的ECL分析方法，用于牛血清中H2S浓度的定量检测，效果良好。本研究结果对复杂生物样品中H2S的检测具有重要的参考价值。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    JEM-2100（HR）型高分辨率透射电子显微镜（日本JEOL 公司）; MPI-EⅡ型电致化学发光检测仪（西安瑞迈电子科技有限公司）; CHI660E电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）; Agilent Cary 60紫外可见分光光度计（美国Agilent Technologies公司）; F-4600荧光分光光度计（日本Hitachi公司）;KQ218型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）; PHS-3E型pH计（上海精密科学仪器有限公司）; FD-1000型冷冻干燥机（埃朗科技国际贸易有限公司）; H1850R型冷冻离心机（湖南湘仪公司）。电化学测试采用三电极体系：修饰的玻碳电极（GCE）为工作电极（φ=3.00 mm），Ag/AgCl电极（饱和KCl）为参比电极，铂电极为辅助电极

    Na2S·9H2O、Cd（NO3）2·4H2O（阿拉丁生物科技有限公司）; 壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司）; 牛血清（浙江天杭生物有限公司）; 乙腈（成都科龙化工试剂厂）; 谷胱甘肽（上海瑞永生物科技有限公司）;K2S2O8（上海化学试剂有限公司）。 其它试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。

    2.2?NGQDs的制备

    参照文献[27]的方法制备NGQDs： 将25 mg柠檬酸溶于12.5 mL水，快速加入500 μL氨水，加入25 mL反应釜中，200℃反应3 h，冷却至室温，超声30 min，用0.22 μm 微孔滤膜过滤并透析（MWCO： 3500 Da）至中性，备用。

    2.3?CdS NCs的制备

    参照文献[22]的方法制备CdS NCs。 将186.0 mg Cd（NO3）2·4H2O溶于30 mL 水中，搅拌下加热至70℃; 将596.0 mg Na2S·9H2O溶解于30 mL 水中，并将此溶液缓慢注入Cd（NO3）2溶液中，立即产生黄色沉淀。将混合液置于70℃反应3 h后，产物离心，沉淀用乙醇和水各洗涤2次。将最终产物超声溶解于水中，9000 r/min离心10 min，收集上层黄色溶液，于4℃保存，备用。

    2.4?修饰电极的制备

    在专用麂皮上依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末对GCE进行处理，再用HNO3（50%，V/V）、乙醇及水超声清洗，室温下用氮气吹干，待用。将适量NGQDs与CdS NCs混合，搅拌1 h。取适量混合液滴涂于处理好的GCE表面上，室温下自然晾干。将适量壳聚糖醋酸溶液（6.67 mg/mL）滴涂于NGQDs/CdS NCs/GCE电极表面，烘干。将修饰好的电极放入不同浓度的Na2S溶液（作为H2S来源[14]）中，37℃下孵育7 min。在含有10 mmol/L H2O2的PBS（0.1 mol/L， pH=9.0）中用电化学发光检测仪进行检测，光电倍增管电压600 V，扫描范围

    1.5～0 V，扫速为50 mV/s。

    2.5?血清中H2S的检测

    将1 μL不同浓度的H2S标准溶液加入到90 μL牛血清中。分别向其中加入60 μL CH3CN，沉淀血清中的蛋白，6000 r/min离心1 min。将140 μL上清液加入到280 μL 40%（V/V）CH3CN中，继续沉淀蛋白，6000 r/min离心5 min。最后，将100 μL上清液样品加入到400 μL超纯水中，将修饰好的电極插入处理好的溶液中，37℃孵育7 min，在含有10 mmol/L H2O2的PBS（0.1 mol/L，pH=9.0）中检测ECL值。

    3?结果与讨论

    3.1?修饰电极的ECL的机理

    传感器制备及检测原理如图1所示。CdS NCs作为半导体纳米晶ECL发光试剂，H2O2为其共反应试剂，可能的反应机理为[18，22]：

    CdS+ne

    →n（CdS）·-（1）

    H2O2+e

    →OH

    + OH·（2）

    OH· + CdS·-→CdS*+ OH

    （3）

    CdS* →CdS+hv（4）

    3.2?NGQDs与CdS NCs的表征

    图2为NGQDs和CdS NCs的紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱图。由图2A可见，NGQDs的特征吸收峰出现在230和345 nm， 230 nm处的吸收峰与π-π*跃迁有关，345 nm处的吸收峰是与CN的n-π*转变相关，证明N元素成功掺杂到量子点中[28]。在345 nm的激发波长下，NGQDs在440 nm处发射很强的荧光。由CdS NCs的紫外吸收光谱及荧光发射光谱（图2B）可见，在471 nm处出现CdS NCs的吸收带， 在511 nm处有最大荧光发射峰。上述结果表明，NGQDs和CdS NCs成功制备。

    3.3?NGQDs/CdS NCs修饰电极的电化学发光和电化学行为

    采用扫描电子显微镜对修饰电极表面的形貌进行了表征。如图3所示，电极表面修饰了较为均一的Chitosan/NGQDs/CdS NCs膜。不同修饰材料对ECL信号值的影响如图4A所示，

    由图可知，NGQDs修饰电极几乎没有ECL信号（曲线a）; CdS NCs/GCE在含有10.0 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS溶液中表现出较弱的ECL信号强度（曲线b）。根据文献[29]报道，H2O2可吸附在其氧化CdS NCs表面形成的S缺陷上，从而可以稳定电化学过程中产生的的OH·，产生ECL信号。对比曲线b和曲线c可知，NGQDs的加入使修饰电极具有突出的ECL性质（曲线c）。这可能是由于NGQDs的高导电率和表面丰富的羧基，可与Cd2+配位，稳定表面S缺陷，导致ECL信号增强。经过5.0×106 mol/L H2S溶液孵化后， 修饰电极的ECL有较大幅度的减弱，这是由于CdS的稳定常数（1.25×1026）非常大，S2可将NGQDs从CdS NCs表面竞争下来，降低CdS·的稳定性。这与文献[22]报道的一致。 NGQDs/CdS NCs混合材料修饰的电极与单个材料修饰的电极相比，ECL值大幅增加。图4B为不同修饰电极相应的CV图。CdS NCs修饰的电极在1.24 V出现还原峰，说明CdS NCs在1.24 V处可被还原，产生CdS）·。NGQDs在0.74 V出现弱的还原峰。当二者混合修饰后，在-1.09 V处出现还原峰，且还原峰电流大幅增大，表明CdS NCs更容易被还原。

    3.4?实验条件的优化

    探讨了影响ECL响应的实验参数，其中复合材料NGQDs/CdS NCs中NGQDs与CdS NCs的体积比是关键因素之一。由图5A可见， ECL响应值先随二者体积比增加而增大， 当体积比为0.5时达到最大值，之后逐渐减小。这可能是因为二者体积比较小时，NGQDs的量过少，协同作用不显著， ECL值降低; 而当二者体积比较大时，参加ECL反应的CdS较少，因此ECL值较低。

    NGQDs/CdS NCs的修饰量也是影响实验的主要因素之一。结果表明（图5B）， 在5.5～8.5 μL范围内，ECL值先随修饰量的增加而增大，在修饰量为7.0 μL时达到最大值， 随后逐渐降低，这是由于过多的修饰材料堆积在电极表面， 阻碍电子的传递，使ECL值降低。

    检测溶液中H2O2含量也可影响ECL值。对其含量进行了优化，结果表明（图5C），当0.1 mol/L PBS中含有10 mmol/L H2O2时ECL值较大，当H2O2含量继续增加时，ECL值变化较小。 考虑到成本，选择含有10 mmol/L H2O2的PBS（0.1 mol/L）为反应溶液。

    另外，还考察了pH值对ECL响应的影响（图6A），结果表明，在其它影响因素不变的情况下，ECL响应在pH 7.0～9.5范围内先随pH值增加而增大，在pH=9时达到最大; 当pH>9后，ECL值反而降低。这可能是由于pH较低时有利于失去质子，而当pH过高时，影响了H2O2的稳定性。

    扫速对ECL响应的影响如图6B所示，在扫速为50 mV/s时ECL响应值最大。在较低扫速时，形成活性反应中间体的速度较慢，不利于ECL反应的进行，而在过高的扫速下，ECL反应时间缩短，也会导致ECL响应值降低。选择最佳扫速为50 mV/s。

    3.5?线性方程和检出限

    在最佳实验条件下，用电致化学发光检测仪检测电化学发光传感器对不同浓度H2S的响应情况（图7）。由NGQDs/CdS NCs修饰电极在不同浓度H2S溶液中的ECL曲线（图7A）可知，随着H2S浓度增加，ECL强度逐渐减小。 ECL变化值（ΔECL， ΔECL =ECLblank-ECLH2S）与H2S浓度的线性相关曲线见图7B，在2.0×1010～2.0×105 mol/L范围内，H2S浓度的对数与ΔECL呈良好的线性关系，其线性回归方程为I = 1186.48×lgCH2S+14762.82（R2=0.9995），检出限（S/N=3）为6.7×10 mol/L。同文献报道的检测方法相比（表1），本方法具有更宽的线性范围或更低的检出限。

    3.6?重现性、稳定性和抗干扰能力

    在最优条件下，使用修饰电极对5 μmol/L H2S连续测定10次， ECL强度值的相对标准偏差（RSD）为0.6% （图8A）。采用相同方法制备7根电极并进行测量，其ECL强度值的RSD为2.1%，表明电极的制备重现性良好。将修饰电极在室温下放置7天后，再次进行检测，发光信号值为初始值的88.8%～91.9%， 表明修饰电极具有良好的稳定性。

    对修饰电极的选择性进行了考察。由图8B可见，浓度为5 μmol/L的胱氨酸、谷胱甘肽、S2O28及Cl对应的ECL响应值与空白实验对应的ECL响应值相差小，而5 μmol/L H2S的ECL值比空白值降低明显。干扰测试结果表明，修饰电极对H2S具有良好的选择性。

    3.7?血清中H2S的检测

    为了评估制备的修饰电极的实用性，将修饰电极用于牛血清样品中H2S的检测，检测结果见表2，加标回收率在92.7%～103.8%之间。因此，制备的修饰电极可用于血清样品中H2S的检测。

    4?结 论

    合成了NGQDs/CdS NCs复合材料，NGQDs表现出了优越的电化学性质，而CdS NCs表现出了较高的发光效率。 在2.0×105～2.0×1010 mol/L范围内，H2S浓度的对数与其相对发光强度呈良好的线性关系，检出限（S/N=3）为6.7×1011 mol/L。将此电极用于血清中H2S的检测， 效果良好， 加标回收率在92.7%～103.8%之间。 NGQDs/CdS NCs修饰电极具有良好的稳定性、重现性及抗干扰能力，为体外快速灵敏检测H2S提供了新方法。

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    Detection of Hydrogen Sulfide Based on Nitrogen-doped

    Graphene Quantum Dots/Cadmium Sulfide Nanocrystals

    Electrochemiluminescence Sensor

    DU Fang-Kai， ZHANG Hui， TAN Xue-Cai*， FENG De-Fen， LUO Yan-Ni

    （School of Chemistry and Chemical and Engineering， Guangxi University for Nationalities，

    Key Laboratory of Guangxi Colleges and Universities for Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry，

    Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Nanning 530006， China）

    Abstract?Nitrogen-doped graphene quantum dots （NGQDs） were synthesized by hydrothermal method with citric acid and ammonia as raw materials. A solid-state electrochemiluminescence （ECL） sensor was thus constructed by dropping NGQDs/CdS nanocluster （NCs） composites. The properties of NGQDs and CdS NCs were characterized by UV-Vis absorption spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The electrochemiluminescent and electrochemical behaviors of the sensor were studied. The results showed that NGQDs could enhance electrochemiluminescence signal of CdS NCs and the stability of NGQDs/CdS NCs increased when H2S was used as the co-reaction reagent of CdS NCs. In the presence of H2S， S2

    bonded with excess Cd2+， and the ECL intensity decreased. Under the optimal conditions， the decrease in electrochemiluminescence intensity varied proportionally with the logarithmic concentration of H2S from 2.0×1010-2.0×105 mol/L， and the detection limit was estimated to be 6.7×1011 mol/L. The sensor was used for the determination of H2S in bovine serum with recoveries of 92.7%-103.8%， which indicated that the proposed sensor had the potential for detection of H2S in practical complex samples.

    Keywords?Electrochemiluminescence; Graphene quantum dots; Cadmium sulfide nanoclusters; Hydrogen sulfide

    （Received 18 September 2019; accepted 18 November 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 11904059）， the Natural Science Foundation of Guangxi Province， China （Nos. 2017GXNSFBA198026， 2018GXNSFAA294044， 2018GXNSFAA281136）， the Key Research and Development Project of Guangxi Province， China （No. AB18126048）， the Basic Ability Enhancement Program for Young and Middle-aged Teachers of Guangxi Province， China （No. 2018KY0168）， and the State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science， Nanjing University （No. SKLACL1810）.