纳米金标记液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定人血清中转铁蛋白
韩亚琛 冯流星 李红梅 熊金平
摘?要?建立了基于纳米金（AuNPs）标记并结合高效液相色谱（HPLC）-电感耦合等离子质谱（ICP-MS）的联用技术，通过测量转铁蛋白（Tf）上标记的AuNPs的量，实现了标准Tf及人血清中Tf的准确定量分析。在本研究中，将Tf与过量的AuNPs在磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中孵育， 形成AuNPs-Tf标记物，之后通过HPLC分离AuNPs-Tf，标记后Tf分子上附着的AuNPs上的Au原子可起到增强信号的作用，通过ICP-MS在线检测AuNPs-Tf上Au的信号，实现复杂血清样品中Tf的准确定量分析。本方法中Tf浓度与AuNPs-Tf上的Au信号强度之间线性关系良好（R2=0.9959），线性范围宽（3个数量级），方法检出限低至6 ng/mL。本方法经标准Tf验证后，用于人血清标准物质（ERM-DA470/IFCC）中Tf的检测，测量结果在标准物质不确定度范围内，回收率在95.2%～102.6%之间。由于AuNPs的信号增强效应和ICP-MS的灵敏检测，相比于传统的以吸光度为检测方式的酶联免疫法，本方法在检出限和灵敏度方面均有明显提升。
关键词?高效液相色谱-电感耦合等离子质谱;纳米金;转铁蛋白
1?引 言
血清中转铁蛋白（Tf）是一种重要的β球蛋白，通过将铁从血浆中结合并转运至细胞， 调节生物体内铁离子平衡[1]，具有增强机体免疫力、促进人体对铁及其它营养物质的吸收等作用。此外，Tf还是一种重要的急性期蛋白，在急性期反应时会逐渐减少，并且在慢性肝病和营养不良时也会下降，因此可以作为营养状况的指标，诊断和监测许多疾病， 如贫血、炎症和冠心病[2]等。
在临床检验中，血清中Tf的常规检测方法主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、免疫比浊法、免疫扩散法[3，4]等，但这些方法在免疫反应中易受所用抗体的影响而导致不同的结果，且检出限较高，通常在0.5 μg/mL以上。为了保证临床检验结果的准确性和有效性，欧盟体外诊断器械指令（IVD 指令）[5]及ISO17511[6]等法规要求， 所有体外诊断产品的校准物、控制物及相关测量程序具有计量溯源性，计量学溯源性的理想终点是国际单位制系统（SI）。因此，迫切需要建立准确、可直接溯源到SI单位的更高等级的人血清中Tf测量方法，从而为Tf临床检测及相关校准物提供溯源基础。
电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）由于其高灵敏度、高稳定性、宽响应范围、低检出限和可同时检测多元素的优点，在生命科学领域得到越来越广泛的应用[7，8]。近年来，基于ICP-MS的蛋白质分析技术已成为蛋白质组学研究中的一种强有力的工具[9]。在本技术中，所有肽或蛋白质等待测物经分离后，可以通过ICP-MS测量其中的元素，如硫、磷、硒和金属元素（如铜、锌和铁）[10，11]，从而实现目标蛋白的绝对定量分析。然而，通过ICP-MS检测天然蛋白质中的元素来定量分析蛋白质的应用有限，只有当目标蛋白已被鉴定或已知其结构时，才可用于定量分析，而许多蛋白质并不含有ICP-MS可检测的元素，且在实际的生物样品中，目标蛋白的浓度通常较低，难以检测。近年来，ICP-MS结合元素标签特别是外源标签，已广泛应用于各种样品中蛋白质的定量分析，如谷物、果树、血清和细胞质等[12～16]。与传统的蛋白质定量分析方法相比，此方法具有以下优点：（1）可通过ICP-MS直接检测标记在蛋白质上的元素，实现绝对定量分析; （2）通常选择样品中浓度较低的元素作为标签，背景干扰小; （3）ICP-MS的线性检测范围宽，适用于不同含量水平蛋白质的分析; （4）与放射免疫分析或化学发光相比，ICP-MS的灵敏度更高[17]，且这种方法具有溯源性。许多元素标签可适用于标记蛋白质，包括金属纳米颗粒、同位素编码亲和标签（ICAT）和载有不同镧系元素的金属螯合标签（MECT）等[18]。其中，纳米金（AuNPs）由于具有良好的生物相容性，表面区域可以固定如氨基酸[19]、蛋白质、酶和DNA[20]等生物分子[21～23]而在生物学领域引起广泛关注。Zhang等[24]通过ICP-MS对AuNPs标记的抗体进行了定量分析，与酶联免疫吸附试验（ELISA）的结果一致;Liu等[25]基于AuNPs标记通过毛细管电泳和ICP-MS联用实现了人尿液中白蛋白的定量分析; Li等[26]采用基于AuNPs标记，并通过ICP-MS法对大肠杆菌O157∶H7实现定量分析。由于AuNPs在生物标记中的诸多优势，已被广泛应用于生物样品检测[27]。
本研究建立了一种基于AuNPs标记，并通过HPLC-ICP-MS联用定量分析人血清中Tf的方法。首先优化了包括缓冲液、pH值等AuNPs和Tf的标记条件，然后将AuNPs标记不同浓度的Tf标准品形成AuNPs-Tf标记物，经HPLC分离后，通过ICP-MS检测标记物上Au的信号强度，Au信号峰面积与Tf浓度之间线性关系良好。将本方法应用于人血清标准物质（ERM-DA470/IFCC）中Tf的定量分析，结果与标准值吻合。由于AuNPs的标记起到了增强信号的作用，并结合ICP-MS的优势，本方法与传统的基于免疫分析的Tf检测方式相比，检出限和灵敏度均有较大提升，具有实现复杂生物基体中低含量蛋白准确定量分析的潜在优势。此外，Tf的定量分析可通过AuNPs最终溯源到SI单位，为临床诊断中Tf的日常检测及相关校准物提供溯源基础，保证临床检验结果的准确性和有效性。
2?实验部分
2.1?仪器与试剂
TU-1810紫外分光光度計（北京Purkinje公司）; 全自动多功能酶标仪（美国POLARstar Omega公司）： 以Milli-Q水作为空白，光谱扫描区间为400～700 nm，光谱分辨率为1 nm。JEM-3010 透射电子显微镜（TEM，荷兰Philips公司），电压200 kV。
LC-30A液相色谱系统（日本Shimadzu公司）包括LC-30AD泵、SIL-20A自动进样器和SPD-20A UV检测器，质量范围为10～500 kDa的SEC尺寸排阻柱TSK-gel G3000SWx1（7.8 mm×300 mm）和阴离子色谱柱Shodex QA-825（8.0 mm × 75 mm）用于蛋白质的分离。
Agilent 7700x电感耦合等离子质谱仪（美国Agilent公司），以Ar为载气，1 ng/mL的7Li、59Co、89Y、140Ce、205Tl作为调谐溶液，测试前将仪器调试至最佳状态。HPLC和ICP-MS的最佳测量参数见表1。
金标准溶液（100 μg/g，10% HCl）和铟标准溶液（100 μg/g，10% HCl）由中国计量科学研究院提供; 氯金酸（HAuCl4·4H2O）、甘氨酸（阿拉丁公司）; 甲酸铵、Tris（北京化工厂）; 磷酸盐缓冲液由色谱纯的NaH2PO4和Na2HPO4配制而成; 标准Tf、IgG、IgA（Sigma公司）; 人血标准物质（ERM-DA470/IFCC，欧洲标准物质和测量研究所）。实验用水为超纯水（Milli-Q纯净水系统，美国Millipore公司）。
2.2?纳米金的制备与表征
取50 mL 0.01% （m/V） HAuCl4于三口烧瓶中，回流加热至沸腾，将1.75 mL 1% （m/V）柠檬酸钠快速加入烧瓶中，加热搅拌30 min，溶液由浅黄色过渡到紫色最终变为鲜红色。反应结束后，继续搅拌20 min，冷却至室温，经0.45 μm滤膜过滤后，于4℃避光保存[28]。通过TEM观察AUNPS粒径大小。AuNPs的浓度由ICP-MS测定，Au单元素系列标准溶液由以1% HNO3配制，标准溶液和样品中加入1 ng/mL In作为内标。
2.3?纳米金与转铁蛋白的标记
在3种缓冲溶液中进行Tf与AuNPs的标记：10 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH 6.8和7.8）; 50 mmol/L硼酸盐缓冲溶液（pH 6.8和7.8）; 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（Na2HPO4-NaH2PO4，pH 5.8、6.8和7.8）。
取1 mL AuNP， s在9000 r/min下离心20 min，弃去上清液，沉淀重悬于1 mL以上缓冲溶液中，加入96孔板中，200 μL/孔[29]，分别加入0.1 mg/mL Tf标准品1、2、4、6和8 μL。 于室温下轻微摇动30 min。 之后向每孔中加入10 μL 12% NaCl溶液，通过多孔板中溶液颜色的变化及吸收峰值大小，考察AuNPs在不同缓冲液中的稳定性及稳定AuNPs所需的最小Tf浓度。
2.4?样品前处理及HPLC-ICP-MS测量
分别取浓度为1、10、25、50、100和200 μg/mL的Tf标准品5 μL， 与200 μL重悬在标记缓冲液的AuNPs混合，37℃避光摇振孵育2 h，以确保反应完全。
对于人血清标准物质ERM-DA470/IFCC样品，根据产品说明提供的方法对样品进行复溶，复溶后的血清样品中Tf浓度为（2.45±0.08） mg/mL，4℃储存，备用。与AuNPs的标记过程同上。
通过双向阀将HPLC的出液管和ICP-MS的进样管相接， 实现HPLC-ICP-MS的联用。样品在进样之前经0.45 μm滤膜过滤，在测量之前对ICP-MS各参数均进行调谐，使仪器灵敏度等参数达到最佳状态，主要干扰（如氧化物）干扰降至1.5%以下，双电荷干扰在3%以下。样品经过HPLC分离后，以最大0.8 mL/min的速度通过进样管进入ICP-MS的雾化器，选择采样速度在1.0 mL/min的雾化器以保证样品进入ICP-MS不会出现积液现象。选择197Au为ICP-MS待检测同位素，匹配与HPLC相同的测试时间， 以实时持续捕捉Au信号，得到整个液相色谱分析过程中的Au信号谱图，信号峰面积通过Origin 8.0积分得到。每个样品重复测试3次。
分别采用尺寸排阻色谱柱（SEC）和阴离子色谱柱（IEC）对血清中的AuNPs-Tf进行分离，并采用ICP-MS在线测量Au的信号。采用SEC-ICP-MS方法时，首先采用ProteoExtractTM白蛋白去除试剂盒去除等电点和Tf相近的高丰度白蛋白Alb（pI= 4.7），然后进行AuNPs标记。
3?结果与讨论
3.1?纳米金与转铁蛋白的标记条件优化
AuNPs与蛋白质的标记效率主要取决于标记缓冲液的种类和pH值，由于蛋白质是两性电解质，每种蛋白质都具有特定的等电点，当标记环境的pH值略高于Tf的等电点5.3时，Tf与AuNPs颗粒间的静电作用较小，表面张力最大，Tf处于微弱的水化状态，而且保留着亲水作用，从而促使Tf和AuNPs结合[30]。
AuNPs溶液中纳米金颗粒间由于存在静电斥力而保持稳定状态，当向其中加入NaCl溶液后，其作为电解质溶液能屏蔽AuNPs颗粒间的静电斥力，导致AuNPs聚集，溶液颜色变蓝，因此对AuNPs的稳定性具有破坏作用。Tf可以吸附在AuNPs表面作为保护层，但吸附的Tf分子数不足时， AuNPs的稳定性仍会被NaCl破坏，因此在AuNPs稳定的前提下所需Tf越少，表明AuNPs所处缓冲液越适合标记。
不同缓冲溶液中AuNPs与Tf的标记显色如图1所示。在Tris-HCl缓冲溶液中，NaCl加入之前AuNPs就已开始聚集显蓝色，因此不適合。向多孔板中加入不同浓度的Tf，30 min后再加入10 μL 12% NaCl溶液，此时硼酸和磷酸盐缓冲液中均不同程度变蓝，采用酶标仪在400～700 nm波长范围对各孔进行扫描，由于分散态和聚集态AuNPs颗粒的光吸收不同，因此可通过吸收峰值大小来选择最佳标记缓冲溶液条件。
AuNPs溶液中Tf浓度对溶液吸收峰的影响见图2，横坐标为各孔中Tf的浓度，纵坐标为测得的各孔吸收值（400～700 nm），分散态和聚集态纳米颗粒的光吸收不同，吸收值越小，表示AuNPs越稳定。图2表明，同一缓冲液中Tf浓度越大，溶液的吸收峰值越小，即AuNPs-Tf粒径越小，
AuNPs与Tf结合的更紧密，溶液的吸收峰达到最小值表示AuNPs和Tf结合稳定，粒径不再发生变化，此时Tf浓度即为稳定AuNPs所需的最小浓度。在本研究中， pH 6.8的磷酸缓冲液中AuNPs的吸收峰与其它标记缓冲相比，在不同Tf浓度下均最小，因此选择此溶液为标记缓冲液，且稳定AuNPs所需的最小Tf浓度为3 μg/mL。
3.2?纳米金及其标记物（AuNPs-Tf）的表征
所制备的用于标记Tf的AuNPs，其粒径大小及均匀性对标记效果有重要影响。粒径小的AuNPs不易聚集，稳定性通常更好，粒径均匀则可降低Tf在AuNPs上结合数量的差异。采用高分辨率透射电子显微镜（TEM）对制备的AuNPs颗粒及AuNPs-Tf进行表征。
如图3A所示，制备的AuNPs呈较为规则的球形，分散均匀。随机选择至少200个AuNPs颗粒观察其粒径大小及分布，由图3B可知，AuNPs平均粒径为15 nm，且粒径分布均应。由于AuNPs具有面心立方结构，可以通过公式（1）计算每个AuNPs平均所含的金原子数目[31]：
NAu=NAπρD3/（6M）（1）
其中， NAu为每个AuNPs颗粒的平均金原子数，Na为阿伏加德罗常数， ρ为AuNPs的密度（1.93×1020 g/nm3）， M为金元素原子质量， D为AuNPs的直径（15 nm）。
经计算，每个AuNPs颗粒含有1.04×105个金原子，单个AuNPs颗粒的重量MAuNPs=NAuM/NA=1.04×105×197/（6.02×1023）=3.41×1017 g。图3C为标记后AuNPs-Tf的TEM图，与图3A相比，AuNPs周边出现了一层由于Tf吸附而形成的光晕，与标记前的AuNPs颗粒有明显区别，证明Tf分子标记在AuNPs颗粒表面。
由于AuNPs颗粒表面具有等离子体共振特性，可在460～560 nm之间观察到强吸收峰，峰值大小取决于AuNPs的大小。图4为AuNPs及其与Tf标记后的400～700 nm的吸收谱图，AuNPs吸收峰位于519 nm，标记后AuNPs-Tf的吸收峰红移5 nm，这是由于AuNPs被Tf吸附而导致吸收峰红移，并且吸收强度比标记前高，证明Tf已标记在AuNPs颗粒上。
本研究制备的AuNPs颗粒中，由ICP-MS测得Au浓度为31.54 μg/mL。结合单个AuNPs的质量（3.41×1017g）， 得到每毫升AuNPs溶液中AuNPs个数为9.25×1011个。
3.3?纳米金与转铁蛋白标记物的HPLC-ICP-MS分析
图5A为不同浓度Tf标准品（1、10、25、50、100和200 μg/mL）的液相色谱图，Tf的保留时间为16 min。 Tf经AuNPs标记后的液相色谱图如图5B所示，在11 min出现了新的AuNPs-Tf吸收峰，这是由于Tf与AuNPs结合后，分子量增大，保留时间减小。当溶液中Tf浓度在25～2500 ng/mL范围内时，由于AuNPs过量，随着Tf浓度增加，AuNPs-Tf不断增多，但当Tf浓度达到5 μg/mL时，AuNPs-Tf不再增多，且16 min处出现未标记的Tf，此时未与AuNPs结合的过量Tf被洗脱出来，图5B右侧的峰是Tf相对于AuNPs， 过量Tf产生的。
在图5C的HPLC-MS图中，在11 min的AuNPs-Tf保留时间处检测到了Au信号，且信号峰面积随着Tf浓度的增加而增大，二者之间存在线性关系，可通过HPLC-ICP-?MS测定样品中的Au实现Tf的定量分析。图5D显示了Tf浓度与AuNPs-Tf中Au信号峰面积之间的关系，AuNPs浓度一定时，当Tf浓度增加到3 μg/mL时，Au信号峰面积最大，AuNPs标记Tf达到饱和。因此，可以在达到饱和以前，建立Tf浓度和AuNPs-Tf上Au信号峰面积的标准曲线。
每个AuNPs上结合的Tf 分子数可由公式（2）计算[18]：
n=NTf SfAuNPs/（NAuNPsSbAuNPs）（2）
其中， NAuNPs为溶液中AuNPs颗粒个数，NTf 为溶液中Tf的分子数，SfAuNPs为AuNPs完全标记时的Au信号峰面积，SbAuNPs 为AuNPs-Tf的Au信号峰面积，结合Tf的摩尔质量（75.2 kDa）， 可计算得到每个AuNPs颗粒上标记了26个Tf分子。
在20～2500 ng/mL浓度范围内，Tf浓度与Au信号呈良好的线性关系（y=0.019969x），线性相关系数R2=0.9959。以纯水为空白，计算标准偏差SD，1 μg/mL Tf标准品标记后单独进样作为标准溶液计算灵敏度S，以3倍的SD计算得方法的检出限为6 ng/mL，7次重复进样的相对标準偏差为4.8%。
3.4?HPLC-ICP-MS定量分析人血清中的转铁蛋白
为了验证本方法对复杂生物基体样品中Tf定量分析的适用性，采用人血清标准物质（ERM-DA470/IFCC）对方法进行验证。将血清样品进行AuNPs标记后，分别采用尺寸排阻色谱柱（SEC）和阴离子色谱柱（IEC）对血清中Tf进行分离，并采用ICP-MS在线测量Au的信号，从而实现对Tf的定量分析。
3.4.1?SEC-ICP-MS测量人血清中的转铁蛋白?血清中有很多种蛋白， 在采用AuNPs标记时，如有其它蛋白也与AuNPs结合，将会对目标蛋白的测量结果产生影响。为避免这一点，首先通过ProteoExtractTM白蛋白去除试剂盒去除血清中等电点与Tf相近的白蛋白（Alb）。图6A为血清样品的液相色谱图，Alb和Tf由于分子量接近而重叠，图6B为去除Alb后的液相色谱图。进一步考察了AuNPs标记Tf的特异性，选择了人血清中含量较高的IgG、IgA、α-1-抗胰蛋白和甘氨酸作为干扰物，经过相同的标记处理后进行分析，这些干扰物与AuNPs孵育后，在液相色谱图上并未产生新峰（图7A），各干扰物的峰形和峰高在标记前后未发生明显变化，在相应的质谱图上也未出现Au的信号峰（图7B）。因此，在本条件（10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH 6.8）下，AuNPs标记Tf未受到血清中其它蛋白的影响。
正常人血清中Tf的濃度约为2.2～4.0 mg/mL，为了保证血清样品中Tf的浓度水平在建立的标准曲线范围之内，将去除白蛋白后的血清标准物质分别稀释30、50和100倍，标记之后经SEC-ICP-MS进行测量。另取样品，加入与样品中浓度大致相同的Tf标准品，测定回收率，结果如表2所示。不同稀释倍数的样品的测定值分别为2.53、2.58和2.64 mg/mL，回收率在95.2%～102.6%之间，测量结果在标准值不确定度范围之内。
3.4.2?IEC-ICP-MS测量人血清中的转铁蛋白?采用另外一种方式考察血清中其它蛋白对Tf测量结果的影响。血清经AuNPs标记后，采用Shodex QA-825阴离子色谱柱分离出血清中AuNPs-Tf的色谱峰，如图8B所示，与未标记血清样品中的Tf保留时间一致（图8A），即在Tf保留时间处出现AuNPs-Tf特征峰，而白蛋白和IgG峰形未受AuNPs标记的影响。在相应的质谱图（图8C）中，在AuNPs-Tf保留时间处检测到了Au信号，IgG处并未检测到Au的信号，而在Alb处有较小的Au信号峰，表明AuNPs也会与Alb有少量标记。此外，质谱图上仍检测到了其它微量Au信号峰，可能是AuNPs和其它未知蛋白标记的结果，但由于Tf已从血清中分离出来，其它蛋白与AuNPs标记后产生的Au信号峰未对AuNPs-Tf上Au信号峰的测定造成干扰。
测量结果如表2所示，不同稀释倍数样品的测定值分别为2.39、2.48和2.52 mg/mL，在标准物质标准值的不确定度范围之内，回收率在94.3%～98.7%之间。
在SEC-ICP-MS方法中，首先需要对血清进行去除白蛋白处理，然后再进行标记定量分析。而IEC-ICP-MS方法可分离出血清中AuNPs-Tf的色谱峰，避免了白蛋白对测定造成的干扰，省去了去除白蛋白处理过程，定量分析结果也更加准确，这两种方法的主要优势体现在检出限、灵敏度和溯源性方面。本方法虽操作较复杂，但其准确性和溯源性更好，可作为溯源链顶端的参考方法，为临床诊断中Tf的日常检测方法及相关校准物提供溯源基础。此外，本方法具有优良的灵敏度和检出限，可用于复杂基体样品中低含量蛋白的检测。
4?结 论
建立了基于AuNPs标记，HPLC-ICP-MS定量分析人血清中的Tf的方法。制备了具有良好分散性和稳定性的粒径为15 nm的AuNPs，优化了AuNPs与Tf的最佳标记条件，建立的方法的检测范围宽（3个数量级），方法检出限显著降低。将本方法应用到复杂人血清样品（ERM-DA470/IFCC）中Tf的定量分析，测定结果与标准值等效一致，证明了本方法对实际样品检测的适用性。本方法在检出限、灵敏度上均有提升，且可通过AuNPs最终溯源到SI单位，为临床诊断中Tf的日常检测及相关校准物提供溯源基础，同时为定量分析复杂样品中低含量蛋白提供了新的方法。
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Quantification of Human Serum Transferrin Based on High Performance
Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass
Spectrometry with Gold Nanoparticles Labeling
HAN Ya-Chen1，2， FENG Liu-Xing*2， LI Hong-Mei2， XIONG Jin-Ping1
1（College of Material Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029， China）
2（National Institute of Metrology， Beijing 100029， China）
Abstract?A simple and sensitive method for quantification of transferrin （Tf） in human serum by high performance liquid chromatography （HPLC） coupled with inductively coupled plasma mass spectrometer （ICP-MS） with gold nanoparticles （AuNPs） labeling was established. Accurate quantification of standard Tf and Tf in human serum were achieved by measuring the concentration of AuNPs labeled on Tf. Tf could be incubated with most amount of AuNPs to form AuNPs-Tf in phosphate buffer （pH 6.8）. Since gold atoms labeled to the Tf molecule could enhance the signals， accurate quantification of Tf in human serum could be achieved by gold signal measurement with ICP-MS after AuNPs-Tf was separated by HPLC. Good linear correlation coefficient （R2=0.9959） was obtained between Au peak area on AuNPs-Tf and concentration of Tf with a wide linear response over 3 orders of magnitude， and the limit of detection was 6 ng/mL. The developed method was successfully applied for detection of Tf in human serum certified reference material （ERM-DA470/IFCC） after being verified by standard Tf. Good agreement was achieved and the quantitative recovery was in the range of 95.2%-102.6%. Due to signal amplification of AuNPs and ultra-sensitive detection of ICP-MS， the sensitivity and accuracy were improved significantly compared to traditional enzyme-linked immunosorbent assay. Moreover， the measurement results could be directly traced to SI unit.
Keywords?High performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry;Gold nanoparticles;Transferrin
（Received 8 July 2019;accepted 24 October 2019）
This work was supported by the National Key Research and Development Program （No. 2017YFF0205402） and the National Natural Science Foundation of China （No.11475163）.
