分子印迹传感器能量转移电化学发光法检测赤霉素

    谢汉钊　杨斌　李建平

    

    

    

    摘 要 制备了赤霉素（GA3）分子印迹传感器，建立了基于共振能量转移原理增强Ru（bpy）3Cl2电化学发光（ECL）信号超灵敏测定GA3的方法。在玻碳电极表面滴涂掺杂Au的g-C3N4材料（g-C3N4/Au），进一步电化学聚合邻苯二胺，得到分子印迹聚合物（MIP）膜，采用甲醇-乙酸洗脱液洗脱后，得到可特异性识别GA3的空穴。以Ru（bpy）32+为探针，g-C3N4/Au为能量供体，利用二者间共振能量转移增强Ru（bpy）32+的ECL强度。同时，ECL共振能量转移与分子印迹技术结合，提高传感器的选择性。随着样品中GA3浓度增加，分子印迹空穴与GA3重新结合， 导致ECL强度逐渐降低。此传感器检测GA3的线性范围为4.0×10-14～7.0×10-11 mol/L，检出限为1.64×10-14 mol/L。将此传感器用于啤酒中GA3检测，回收率为95.7%～103.7%。

    关键词 分子印迹; 赤霉素; 电化学发光; 共振能量转移; g-C3N4/Au

    1 引 言

    分子印迹电化学传感器是能选择性识别特定分子并产生信号变化的检测装置[1]，广泛应用于环境分析、食品安全、生物医药检测等领域[2，3]。然而，传统的分子印迹电化学传感器因受限于分子印迹聚合物（MIP）导电性弱和电活性差， 导致其灵敏度不高。分子印迹电化学发光法集电化学发光（ECL）的高灵敏度和分子印迹技术的高选择性于一体，有较好的发展前景[2，4]。然而，常规的ECL强度因受施加电位影响，产生光子能量较高但数量较少，灵敏度相对较低。电化学发光共振能量转移（ECL-RET）利用供体在电极表面发生电化学反应后， 将能量转移给受体，使受体吸收能量而发光，可显著提高ECL分析灵敏度[5，6]，因而在DNA、蛋白质、细胞及无机分子检测等研究中得到应用[7～10]。

    赤霉素（GA3）是植物生长发育不可缺少的激素之一，在育苗、保护地栽培以及露地栽培等方面广泛使用。但是，GA3会影响动物的生长发育，甚至导致机体发生癌变，因此检测GA3具有重要意义。目前，检测GA3的方法有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、伏安分析法、表面增强拉曼散射法等[11～14]，但这些方法存在灵敏度不高、选择性差、需要复杂的前处理、仪器昂贵、溶剂用量大等缺点。本研究组曾利用分子印迹ECL传感器测定GA3[15]，但该方法灵敏度仍有待提高。

    g-C3N4是一种高效、稳定的发光材料，已被用于制备多种类型的化学传感器[16]。g-C3N4/Au的发射峰与Ru（bpy）3Cl2的吸收峰相近，可发生能量转移而得到更强的ECL信号，提高检测灵敏度[17]。在此基础上，本研究构建了以g-C3N4/Au为基质的分子印迹传感器，利用g-C3N4/Au供体与Ru（bpy）3Cl2受体间发生能量转移从而大大增强ECL信号的ECL共振能量转移原理，结合“门控制”效应[18]，提高检测的灵敏度。传感器制备过程及检测原理如图1所示。在玻碳电极上修饰一层g-C3N4/Au材料，以GA3作为模板分子，邻苯二胺作为功能单体，电聚合制备分子印迹传感器。将模板分子洗脱后，得到可识别GA3的印迹空穴。施加电压，使g-C3N4/Au处于激发态，当Ru（bpy）32+通过空穴到达电极表面，激发态g-C3N4/Au的能量转移到Ru（bpy）32+，使ECL信號增强，实现对GA3的高灵敏检测。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    PGSTAT128N Autolab电化学工作站（瑞士万通有限公司）; MPI-E型电化学发光分析系统（西安瑞迈仪器有限公司）;? PHS-3C型实验室pH计（上海锦幻仪器仪表公司）; 80-2B离心机（金坛市医疗仪器厂）;? AVANCE III Bruker-500 MHz核磁共振仪（荷兰Bruker公司）; ∑IGMA场发射扫描电子显微镜（德国卡尔蔡司公司）; TU-1901紫外-可见光分光光度计（北京普析通用公司）; JEM-2100F场发射透射电子显微镜（日本电子株式会社）; 日立F-7000荧光分光光度计（株式会社日立制作所）。采用三电极系统：工作电极为直径2 mm的玻碳电极（GCE），对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl。

    邻苯二胺、GA3和联吡啶钌（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 三聚氰胺（C3H6N6，国药集团化学试剂有限公司）; 二水合柠檬酸三钠、K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]、KCl（汕头陇西化工厂）; NaBH4（国药集团化学试剂有限公司）。 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（含0.1 mol/L KCl，pH 8.0）; 0.2 mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含0.1 mol/L KCl，pH 9.0）; 0.005 mol/L K3[Fe（CN）6]-K4[Fe（CN）6]溶液（含0.1 mol/L KCl）。 所用试剂均为分析纯，无需纯化。实验用水为蒸馏水。

    2.2 修饰材料的制备

    2.2.1 g-C3N4的制备 参照文献[19]合成g-C3N4。准确称取10 g三聚氰胺， 均匀地放入带盖的陶瓷坩埚中，将其放入马弗炉中进行高温烧结：在120 min内升温至500℃并恒温反应120 min，再加热到520℃恒温反应120 min，自然冷却至室温，取出样品，研磨过筛，即得到g-C3N4的粗品。

    参照文献[20]对所得粗品进行提纯：将制得的g-C3N4粗品溶于水中，超声处理30 min， 离心并水洗3次，去除可溶性的反应物和杂质，再用无水乙醇清洗并离心3次，以去除一些有机杂质，在60℃下干燥，将所得样品研磨至粉末，备用。

    2.2.2 g-C3N4/Au的制备 参照文献[20]合成g-C3N4/Au。准确称取10 mg g-C3N4溶于4 mL去离子水，超声处理30 min，然后加入20 μL 0.1 mol/L HAuCl4。超声处理10 min，搅拌30 min，重复3次。加入126 μL 0.04 mol/L NaBH4，搅拌20 min。继续加入200 μL 0.01 mol/L柠檬酸三钠，继续搅拌30 min。离心并水洗3次，去除可溶性的反应物和杂质，最后溶于4 mL水中。

    2.3 MIP膜修饰电极的制备

    用0.05 μm Al2O3粉将GCE抛光，然后分别在HNO3（1∶1，V/V）、无水乙醇、水中超声洗涤5 min，然后参照文献[20]将g-C3N4/Au滴涂到GCE上。将邻苯二胺用硼酸-硼砂缓冲溶液（pH 9.0）溶解，将电极置于10 mL含1.0×10-4 mol/L邻苯二胺和1.0×10-4 mol/L GA3聚合液中进行循环伏安扫描，电位范围-0.2 ～+0.6 V，聚合20圈。使用同样的方法，用硼酸-硼砂缓冲溶液代替GA3溶液加入到聚膜液中，制得非分子印迹（NIP）修饰电极; 使用同样的方法，在未修饰GCE上制备MIP膜。将已制备好的MIP、NIP修饰电极和未修饰复合材料的MIP电极置于甲醇-乙酸（8∶3，V/V）溶液中，洗脱150 s，去除膜中的模板分子GA3及膜表面的附着物，用水清洗后，晾干，备用。

    2.4 测量方法

    电化学测试在0.005 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]（含0.1 mol/L KCl）溶液中進行。扫描速率为50 mV/s，电压扫描范围为-0.2 ～0.6 V; 交流阻抗（EIS）法的恒电位为0.190 V，交变电压5 mV，频率范围100 mHz～100 kHz。

    ECL信号测试是将制备好的工作电极置于不同浓度的GA3溶液中进行重吸附后，将其浸入到7 mL发光底液中，采用三电极系统测定发光强度。电压扫描范围为0～1.2 V，扫速为100 mV/s，光电倍增管高压800 V，放大倍数为4级。发光底液由5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液与2 mL 1.5 mmol/L联吡啶钌溶液混合得到。

    3 结果与讨论

    3.1 复合材料g-C3N4/Au的形貌和成分表征

    对制备的g-C3N4/Au进行EDX能谱测试，如图2A所示， g-C3N4/Au复合材料中包含Au、N、C等元素，说明成功制备了复合材料g-C3N4/Au。

    g-C3N4/Au复合材料的X-射线衍射图见图2B。g-C3N4在27.7°处有一个特征峰（002），与晶面堆积的共轭芳香体系有关。掺杂纳米金后，g-C3N4/Au在38.1°和44.4°出现金的特征峰，晶面类型分别是（111）和（200）。上述结果表明， g-C3N4/Au复合材料合成成功。

    g-C3N4和g-C3N4/Au的透射电镜和扫描电镜表征结果见图3。在图3A和3C中，g-C3N4呈现片状分布; 在图3B和3D图中，可见一些颗粒状物质均匀分布于g-C3N4表面，这些颗粒多呈球形，直径约30 nm。 综合图3的结果，可以判断这些颗粒为纳米金，附着于g-C3N4表面，即得到g-C3N4/Au。

    3.2 MIP的电聚合

    采用循环伏安法（CV）进行MIP的电聚合[20，21]。在GCE表面电聚合邻苯二胺是不可逆的氧化过程，且随着电聚合扫描圈数不断增加，氧化峰电流明显降低，并趋于稳定，说明随着扫描圈数的不断增加，在GCE上逐渐生成一层致密的MIP膜，阻碍了电子传递，导致氧化峰电流随着扫描的进行而不断降低。

    3.3 MIP膜的差分脉冲伏安法（DPV）和CV表征

    利用DPV和CV法对MIP膜的电化学性能进行研究。GA3本身在扫描范围内无电活性，选择在0005 mol/L K4[Fe（CN）6]-K3[Fe（CN）6]溶液（含0.1 mol/L KCl）中进行表征，在-0.2～+0.6 V范围内进行扫描并记录响应曲线。如图4所示，K4[Fe（CN）6]-K3[Fe（CN）6]探针在GCE上有明显的氧化峰（曲线a），修饰g-C3N4/Au后，氧化峰增强（曲线b），这是因为g-C3N4/Au具有良好的导电性能及较大的比表面积，增强了探针分子的氧化峰信号。进一步在其表面电聚合形成MIP后，由于MIP膜致密且导电性较差，严重阻碍电子的传递能力，氧化峰电流急剧下降（曲线c）; 而用洗脱液洗脱模板分子后，探针分子氧化电流强度增大（曲线d），这是由于模板分子去除后，印迹孔穴作为电子传递通道，利于探针分子通过MIP进行电子传递; 而将电极置于8.0×10-12 mol/L GA3溶液中进行重吸附后，由于印迹孔穴与模板分子GA3重新复合，GA3重新占据印迹孔穴，电子传递通道被堵塞，导致氧化峰电流下降（曲线e）。上述结果说明，此印迹孔穴对GA3分子有识别吸附作用。

    为排除识别的非特异性吸附的因素，考察了不含模板分子的印迹膜（NIP）对目标分子的识别效果，结果见图4插图，对于NIP，电聚合过程后（曲线f）和进一步洗脱后（曲线g）的氧化电流值都很小，且与电聚合得到的MIP的电流值相当，说明NIP不能提供电子探针参加电极反应的通道。因此，NIP对GA3不产生识别吸附，即可排除MIP的非特异性吸附。

    3.4 MIP膜的EIS表征

    MIP传感器的表面阻抗的变化如图5（拟合软件：ZSimDemo 3.30d）所示。曲线a为GCE（194 Ω）; 曲线b为g-C3N4/Au修饰GCE（180 Ω）。对于MIP修饰GCE，电极表面的电阻增大（曲线c，12200 Ω）; 当模板分子被洗脱后，传质通道被打开，电导率增加，电阻降低 （曲线d，322 Ω）。重吸附不同浓度GA3后，由于印迹空穴被重新占据，传质通道被堵塞，电极的电阻增大（曲线e，556 Ω; 曲线f，806 Ω）。EIS表征与CV、DPV表征结果一致，证明MIP修饰电极已经制备成功。

    3.5 实验条件优化

    3.5.1 MIP膜聚合膜条件优化 改变模板分子与功能单体的配比（1∶3，1∶4，1∶5）进行MIP合成条件的优化，发现配比为1∶3时，MIP膜的稳定性、洗脱效果等最优。此外，分别考察MIP膜聚合时，扫描15、20、25和30圈得到的MIP。当聚膜圈数为20圈时，聚合后的电流趋于稳定，同时洗脱时间也适中（约150 s），因此选择聚膜扫描圈数为20圈。

    進一步探索此体系在ECL中的能量转移情况。图11是MIP-ECL传感器在不同情况下的ECL信号变化。 曲线a为洗脱后的未修饰g-C3N4/Au复合材料的MIP电极。由于g-C3N4/Au复合材料与发生能量转移作用，增大了发光强度（曲线b），证明已经修饰上g-C3N4/Au。当重吸附不同浓度的GA3后（曲线c和曲线d），印迹空穴被不同程度堵住，g-C3N4/Au与Ru（bpy）3Cl2能量转移效率降低，ECL的响应信号也相应降低。同时，对比曲线a和b的ECL强度可知，能量转移作用增强了ECL信号，放大倍数约为3倍，能量转移对ECL信号起到明显的放大作用。

    3.10 实际样品分析

    3个不同品牌的啤酒样品购于本地超市。将啤酒进行超声振荡排气，过滤后，取0.01 mL稀释至4 mL。采用g-C3N4/Au-MIP传感器测定GA3浓度，结果见表2，GA3回收率为95.7%～103.7%，RSD<5%。

    4 结 论

    制备了MIP传感器，基于g-C3N4/Au增强Ru（bpy）3Cl2的电化学发光信号的ECL-RET原理建立了GA3的测定方法。与已报道的检测方法相比较，本方法特异性好、灵敏度高、检出限低。同时，利用MIP传感器的ECL-RET法为其它不能或产生极弱电化学发光的物质的检测提供了新思路。

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    A Molecularly Imprinted Electrochemical Luminescence

    Sensor for Detection of Gibberellin Based on Energy Transfer

    XIE Han-Zhao， YANG Bin， LI Jian-Ping*

    （College of Chemical and Bioengineering， Guilin University of Technology，

    Guangxi Key Laboratory of Electrochemical and Magnetochemical Function Materials， Guilin 541004，China）

    Abstract A molecularly imprinted sensor was fabricated， and a method based on enhancing electrochemiluminescence （ECL） signal of Ru（bpy）3Cl2 using resonance energy transfer （RET） was established for ultra-sensitive determination of gibberellin （GA3）. Au-doped g-C3N4 （g-C3N4/Au） was prepared on the surface of glassy carbon electrode， and then o-phenylenediamine was electropolymerized to achieve a molecularly imprinted polymer （MIP） film. The film was then eluted by methanol-acetic acid to obtain molecularly imprinted cavities for specifically recognizing GA3. Ru（bpy）32+ was used as probe and g-C3N4/Au was used as energy donor. The RET between Ru（bpy）32+ and g-C3N4/Au was used to enhance ECL intensity of Ru（bpy）32+. In addition， ECL-RET was combined with molecular imprinting technology to improve selectivity of the sensor. With the increase of the concentration of GA3， the molecularly imprinted cavities recombined with GA3， which made the ECL intensity gradually decreased. Under the optimized conditions， there was a linear relationship between ECL intensities and GA3 concentrations in the range from 4.00×10-14 mol/L to 7.00 ×10-11 mol/L， and the detection limit was 1.64×10-14 mol/L （3S/K）. The sensor was successfully applied to the detection of GA3 in beer， and the recoveries were 95.7%-103.7%.

    Keywords Molecularly imprinting; Gibberellins; Electrochemical luminescence; Resonance energy transfer; g-C3N4/Au

    （Received 5 April 2020; accepted 8 August 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21765006）， the Guangxi Natural Science Foundation of China （No. 2018GXNSFAA138145） and Guangxi?Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area， China.

    2020-04-05收稿; 2020-08-08接受

    本文系國家自然科学基金项目（No.21765006）、广西自然科学基金项目（No.2018GXNSFAA138145）和广西岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心项目资助

    * E-mail： likianping@263.net