小分子靶标的核酸适配体筛选研究进展

    王子健 陈尔凝 杨歌 赵新颖 屈锋

    

    

    

    摘?要?核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子，在小分子传感分析和检测中有很大的应用潜力。小分子的Aptamer筛选是其应用的前提。本文综述了2015～2019年，有关毒素、抗生素、激素等近80种小分子的Aptamer的筛选研究进展，归纳总结了近百条Aptamer序列和平衡解离常数KD及其测定方法，简要介绍了基于氧化石墨烯、人类基因组、石英晶体微天平以及计算机辅助筛选等改进型指数富集配体系统进化技术。

    关键词?核酸适配体;小分子;指数富集配体系统进化技术;综述

    1?引 言

    近年来，核酸适配体（Aptamer）在小分子的传感分析和检测应用中的研究发展迅速，主要用于食品和环境检测以及生物分析等领域。小分子与蛋白质大分子、细胞和微生物复合靶标不同，分子量小（一般<1000 Da），与核酸的结合位点少、亲和力弱。因此，小分子的Aptamer的筛选方法与蛋白质和细胞等复合靶标也有所不同。2016年，本研究组撰写了综述论文“小分子靶标的核酸适配体筛选研究进展”[1]，介绍了四十余种小分子的Aptamer序列及筛选要点。在此基础上，本文综述了2015～2019年小分子Aptamer的筛选进展，主要包括毒素、抗生素、激素等小分子的Aptamer序列和平衡解离常数（Equilibrium dissociation constants，KD）及其测定方法，简单介绍了基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）、人类基因组（Human-genomic）、石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）以及計算机辅助（In silico）等改进型指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）及其应用。

    2?小分子靶标分类

    2.1?毒素

    毒素类分子因具有毒性，很难产生抗体，故利用抗体检测毒素难以实现。因此，筛选毒素分子的Aptamer并构建传感元件，是实现毒素快速检测的新思路。

    蛤蚌毒素（Saxitoxin，STX，C10H17N7O4，299.29）是一种常见的神经毒素。在Handy等[2]发表的Aptamer序列基础上，2015年，Zheng等[3]对其G-四链体结构的第30个位点进行突变，以G代替T，得到新的Aptamer序列5-GGT ATT GAG GGT CGC ATC CCG TGG AAA CAG GTT CAT TGG GCG CAC TCC GCT TTC TGT A GA TGG CTC TAA CTC TCC TCT-3，其亲和力提高了约30倍。在保留核心颈环结构前提下，将上述序列截短为34个碱基，其KD与截短之前相同，均为nmol/L级。2018年，Gu等[4]筛选得到的Aptamer，KD=（61.44±23.18） nmol/L。2019年，Ha等[5]用筛选得到的Aptamer构建表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）传感器，检测实际样品中STX的线性范围为5～10000 μg/L，检出限为2.46 μg/L，为STX Aptamer的应用提供了重要参考。

    大田软海绵酸（Okadaic acid，OA，C44H68O13，805.00）是从海绵体中分离出的一种腹泻性贝类毒素。2015年，Lin等[6]将筛选到的4条Aptamer候选序列作为新型无毒探针，分别与抗OA的单克隆抗体（OA-Mab）竞争，得到具有与游离OA毒素相似竞争功能的Aptamer，KD=0.68 nmol/L，半数抑制浓度（IC50）为3.39 ng/mL，IC10为0.33 ng/mL。2016年，Gu等[7]将筛选到的4条Aptamer候选序列（KD<100 nmol/L），分别与OA结构相近的鳍藻毒素（Dinophysistoxins，DTX-1 & DTX-2，C45H70O13，819.03）、软骨藻酸（Domoic acid，DA，C15H21NO6，311.33）和STX进行特异性实验，得到与OA特异性结合最好的Aptamer，KD=42 nmol/L。保留其核心结构，将该序列截短后，其KD仍为（40±13） nmol/L，亲和力得以保持。

    赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA，C20H18ClNO6，403.81）是由多种生长在粮食、花生、豆类等农作物上的曲霉和青霉菌产生的。2014年，McKeague等[8]筛选到了DNA Aptamer，KD=（290±150） nmol/L。将引物区截掉后，得到长度仅为40个碱基的DNA Aptamer，其中包含的GTGGG结构，是Aptamer与OTA发生亲和作用的关键区域。2015年，刘继红等[9]筛选得到长度为30个碱基的Aptamer，KD=0.21 μmol/L，与OTA结合力强于赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB，C20H19NO6，369.37）100倍。尽管OTA和OTB之间仅差一个氯原子，OTA的Aptamer也可实现有效区分。2018年，Rangel等[10]报道了OTA的苏糖核酸（Threose nucleic acid，TNA） Aptamer。与DNA的磷酸二酯键链接五碳糖呋喃环的5到3不同，TNA的磷酸键链接四碳呋喃环的3～2位。这种骨架修饰结构使得体外转录和反转录酶更有效，稳定性增加，更适用于体外筛选。利用KOD RI酶和含有不同碱基的三磷酸TNA引物对ssDNA初始库转录得到TNA库，然后利用TNA库和OTA修饰的磁珠孵育，分离得到与OTA结合的TNA序列。通过DNaseⅠ将该TNA序列逆转录成互补的cDNA，该cDNA扩增后得到的互补链，可作为下一轮次筛选的核酸库。经过9轮次筛选，得到OTA的TNA Aptamer，KD=（92±2） nmol/L。将OTA的TNA Aptamer截短为31个碱基，KD=（71±8） nmol/L，亲和力基本保持不变。与OTA 的DNA Aptamer（40个碱基）的KD （（148±3） nmol/L）相比，TNA（31个碱基）的亲和力提升了近一倍。

    上述3种靶标（STX、OA和OTA）筛选Aptamer的研究说明，同一靶标可筛选获得多条Aptamer序列，且截掉部分非关键碱基并不影响Aptamer的功能。因此，利用计算的方法对现有Aptamer序列进行改造，通过理性设计定点突变或截短序列，有可能获得更高亲和力的Aptamer。

    α-鹅膏[蕈]毒环肽（α-Amanitin，C39H54N10O14，918.97）是从致命鹅膏毒伞子实体中分离的多肽，是一种致死性毒素。2016年，汪颖等[11]利用以亲和填料Epoxy-Activated Sepharose 6B为筛选介质的亲和色谱法筛选得到α-鹅膏[蕈]毒环肽的Aptamer。利用酶联寡聚核苷酸吸附实验（Enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）测得KD=（2.919 ±1.199） nmol/L。2017年，Muszynska等[12]利用琼脂糖微球-Capture-SELEX筛选得到α-鹅膏[蕈]毒环肽的另一条Aptamer，利用蛋白质体外结合实验（Pull-down assay）测得KD=（5.026 ± 0.690） μmol/L。这说明，针对相同靶标，筛选方法不同，测定方法不同，Aptamer 的KD相差很大。这是Aptamer筛选研究中普遍存在的问题，也是制约Aptamer广泛应用的因素。

    目前报道的毒素分子的Aptamer很多[13～23]，其中岩沙海葵毒素（Palytoxin，PTX，C129H223N3O54，2680.14）分子量接近3000。2017年，Gao等[23]筛选得到PTX Aptamer，KD=0.84 nmol/L，构建傳感器用于检测实际样品中的PTX，线性范围为200～700 pg/mL;检出限为0.04 pg/mL。该Aptamer在PTX的实时、超灵敏、快速定量检测中有巨大的应用潜力。此外，以胶霉毒素、鱼腥藻毒素a、软骨藻酸、肉毒神经毒素E、黄曲霉毒素B1、霍乱毒素、微囊藻毒素-RR、河豚毒素、伏马毒素 B1、短裸甲藻毒素、膝沟藻毒素1/4和黄曲霉毒素B2为靶标的Aptamer均有报道，序列、筛选方法和KD及其测定方法，详见表1。

    2.2?抗生素

    抗生素是一类非常重要的小分子靶标，其Aptamer的筛选一直备受关注。

    妥布霉素（Tobramycin，C18H37N5O9，467.52）和链霉素（Streptomycin，C21H39N7O12，581.57）均属于氨基糖苷类抗生素。2015年，Spiga等[24]筛选得到妥布霉素的DNA Aptamer，KD=230 nmol/L，截掉引物区后KD=520 nmol/L。同时验证了Verhelst等筛选得到的RNA Aptamer的KD = 200 nmol/L，这说明筛选得到的DNA Aptamer和RNA Aptamer的亲和力相当。Han等[25]筛选得到妥布霉素Aptamer的KD=（56.88±4.61） nmol/L。截短该序列，分别得到34个碱和49个碱基的序列，二者的KD分别为（48.40±6.63） nmol/L和（46.77±9.84） nmol/L。Soheoli等[26]筛选得到链霉素的Aptamer，截去引物区域后KD=151.9 nmol/L，对该序列进行截短得到含23个碱基的序列，KD=132.3 nmol/L，亲和力基本没有变化。这说明对筛选得到的Aptamer 序列进行适当有效的截短，并不影响Aptamer的亲和力。

    苄青霉素又称青霉素G（Benzylpenicillin，C16H18N2O4S，334.39），是β-内酰胺类抗生素。Paniel等[27]筛选得到11条Aptamer候选序列，将其分别键合在琼脂糖色谱柱上，利用对苄青霉素的保留能力的差别，筛选得到保留率为46.5%的Aptamer。Lee等[28]在设计引物时，分别添加了限制性酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对特定位点进行保护，防止引物序列错配对Aptamer结构的影响，并筛选得到苄青霉素的Aptamer。上述报道表明，引物序列有时可影响Aptamer的亲和力。直接去掉引物序列，可能造成亲和力下降，筛选时需要考虑引物序列对靶标结合的影响，而必要的核酸序列结构设计，可有效增加Aptamer的亲和力。

    环丙沙星（Ciprofloxacin，CFX，C17H18FN3O3，331.35）是氟喹诺酮类抗生素。Groher等[31]经过10轮筛选，得到CFX的RNA Aptamer。与DNA Aptamer筛选不同，RNA Aptamer每轮的PCR扩增前需将RNA反转录为DNA，测序后再将DNA转录为RNA。此外，泊沙康唑、氧氟沙星、磺胺甲嘧啶、氟苯尼考、头孢喹肟、洛美沙星和恩诺沙星等的Aptamer均有报道，序列、筛选方法和KD及其测定方法[24～39]详见电子版文后支持信息表S1。

    2.3?激素

    激素是影响动植物生长的重要小分子，也一类重要靶标。

    克伦特罗（Clenbuterol，CLB，C12H18Cl2N2O，313.65）是一种肾上腺类神经兴奋剂。Duan等[40]采用MB-SELEX，经过16轮筛选得到Aptamer，利用GO吸附法测得KD=（76.61±12.70） nmol/L。Liu等[41]通过MB-SELEX经过8轮次筛选和序列优化，得到Aptamer，纳米金比色法测定KD=（42.17±8.98） nmol/L。本研究组[42]利用毛细管电泳筛选法（CE-SELEX），经过4轮筛选得到Aptamer，激光诱导荧光毛细电泳法（Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detector，CE-LIF）测定KD=931.5 nmol/L。Duan等[40]和Liu等[41]，针对相同靶标，采用相同的筛选方法，不同的核酸库的设计、筛选轮次和亲和力表征方法，得到Aptamer序列和结合力也不同，且筛选轮次与Aptamer的亲和力并非正相关。Duan等[40]和本研究组[42]，针对相同靶标，采用了相同的核酸库引物序列，但筛选方法、亲和力表征方法不同，得到的Aptamer序列和亲和力也不同。值得注意的是，本研究组利用CE-SELEX，所需筛选轮次更少，筛选成本更低;但是，CE-LIF表征的是CLB和Aptamer结合的非平衡过程，所测得的KD相较其它方法偏大。

    17β-雌二醇（β-Estradiol，C18H24O2，272.38）是一种性激素，在卵泡液、胎盘和妊娠尿中均可检出。Akki等[43]针对17β-雌二醇和其结构类似物17α-炔雌醇，经过10轮筛选得到二者的Aptamer，KD分别为（5.6±1.0） μmol/L和（9.5±0.9） μmol/L。Vanschoenbeek等[44]针对17β-雌二醇结构中的环戊四氢菲和羟基芳香烃两个同官能团进行Aptamer筛选。相同筛选条件下，以环戊四氢菲为识别位点的结合缓冲液，采用10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-[2-hydroxyerhyl]?piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES），筛选5轮;以羟基芳香烃为识别位点用的结合缓冲溶液，采用10%乙醇-PBS混合液，筛选10轮。可识别环戊四氢菲位点的Aptamer序列在引物序列存在时形成三通结构，而识别羟基芳香烃位点的Aptamer则存在G四链体结构，二者的KD分别为36 μmol/L和0.9 μmol/L。这说明以小分子中不同官能团为靶标进行Aptamer筛选，也可以精准地实现结合位点的识别。

    值得关注的是，Yu等[45]以新型致幻类药物的主要成分3，4-亚甲基二氧吡咯戊酮（3，4-Methylenedioxy pyrovalerone，3，4-MDPV）为靶标，在含有三通（Threeway junctions，TWJ）结构的核酸库中筛选得到Aptamer，KD=（6.1±0.2） μmol/L。该Aptamer可以在室温条件下，几秒钟内实现毒品中的3，4-MDPV的检测，检出限为300 nmol/L，特异性高，可区分结构相似的苯丙胺、甲基苯丙胺和多巴胺等分子，在快速灵敏检测方面具有应用潜力。此外，17α-炔雌醇、α-聚乙烯吡咯烷酮、黄体酮、地塞米松、玉米烯酮和雄性甾体激素等的Aptamer均有报道，其序列、筛选方法和KD及其测定方法[40～50]详见电子版文后支持信息表S2。

    2.4?其它小分子

    生物胺/碱、多肽、天然产物、染料、农药、重要单体小分子靶标以及金属离子的Aptamer也有报道，其序列、筛选方法和KD及其测定方法[51～84]详见电子版文后支持信息表S3。

    2019年，Dwidar等[51]报道了组胺（Histamine，C5H9N3，111.15）的RNA Aptamer，KD=0.37 μmol/L，并设计了稳定的核糖开关，可在组胺存在时激活蛋白质表达。将该RNA Aptamer导入人造细胞中，能够实现对其包裹的小分子的控制释放，可作为一种自毁式杀伤开关。同年，Mairal等[52]报道了组胺的DNA Aptamer，KD=（3.08±1.13） nmol/L，用于磁珠竞争法检测缓冲液和人工尿液中组胺，检出限分别达到18 和76 pmol/L。这些结果凸顯了小分子Aptamer检测策略的适用性，促进了快检装置的开发。上述结果说明，组胺的RNA Aptamer更适合体内蛋白表达的调节应用，而DNA Aptamer更适用于体外快速检测应用。

    2017年，Abdelsayed等[60]筛选得到了5-三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP，C10H16N5O13P3，507.18）的RNA Aptamer，由153个碱基组成，是本文中所报道的最长Aptamer。其KD偏高，为（1.7±0.6） mmol/L，但通过某些点位的突变，也可实现特异性识别。这说明Aptamer的亲和力不一定是越高越好，以满足实际需求为导向的Aptamer筛选也是一种趋势。

    2018年，Luo等[75]利用琼脂糖亲和色谱筛选得到肌氨酸（Sarcosine，C3H7NO2，89.09）的Aptamer，进行有效截短后，KD=（134.8±1.12） nmol/L。2019年，Ozyurt 等[76]利用GO-SELEX法筛选得到肌氨酸的Aptamer，KD=（0.33±0.05） nmol/L，亲和力提升了400倍，为小分子靶标的高灵敏度检测提供了前提。

    3?改进型筛选方法

    高效的筛选方法一直是Aptamer研究的关键。目前，Aptamer的筛选仍然以SELEX技术为基础，其中，磁珠结合SELEX（MB-SELEX）是目前筛选小分子Aptamer最主要的方法。根据靶标分子选择修饰磁珠进行靶标固定，筛选方法灵活、成本低，不需要特殊设备。相比之下，琼脂糖凝胶亲和色谱法筛选法是最传统的筛选方法，凝胶材料容易获得。近年来，基于新材料GO的SELEX应用越来越广泛。

    3.1?GO-SELEX

    GO是SELEX中应用效果最好、报道最多的新型材料。它亲水性强，在水溶液中分散性好，能降低表面自由能，是一种非常好的反应介质。2012年，Park等[85]首次提出了GO-SELEX技术，并筛选到了烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyl transferase，Nampt）蛋白的Aptamer。GO-SELEX法的优势在于不需要对靶标进行固定，避免了靶标固定的繁琐程序，并使靶标的天然构象得以保持。利用GO-SELEX技术筛选的Aptamer的亲和力明显增加。如利用MB-SELEX筛选到肌氨酸Aptamer的KD=（134.8±1.12） nmol/L，而利用GO-SELEX筛选到的Aptamer的KD=（5.63±3.55） nmol/L，亲和力提升了约24倍。使用磁还原氧化石墨烯（Magnetic reduced graphene oxide，MRGO）辅助筛选，亲和力有所提升。如利用MB-SELEX筛选蛤蚌毒素的Aptamer，KD=3.84 μmol/L，而利用MRGO-SELEX筛选蛤蚌毒素的Aptamer，KD=（50.75±14.97） nmol/L，亲和力提升了约7倍。利用MGRO材料，还可以快速吸附去除未结合的ssDNA，使分离步骤大大简化。也可以使用吸附了氧化石墨烯的纳米粒子（GO-adsorbed nanoparticles）进行金属离子的Aptamer筛选，如Cho等[81]利用该技术筛选了钯离子的Aptamer。综上，GO等新型材料的使用，可有效提升Aptamer的筛选效率，增加Aptamer的亲和性。

    3.2?人类基因组-SELEX（Human-Genomic SELEX）

    传统的SELEX技术都采用人工合成的ssDNA或RNA库，序列的随机性较强，与生物体内的实际核酸序列有一定差异。2017年，Abdelsayed等[60]?利用人类基因组筛选可结合ATP的RNA Aptamer。首先对人血清中的RNA进行提取与表达，以这些天然存在的RNA序列为初始核酸库，利用Apta-Seq流程进行Aptamer筛选。通过SHAPE技术对该核酸库进行选择，标记在RNA序列上的染料在转录到DNA的过程中切断序列，从而进行高通量测序。该方法使用了天然RNA作为核酸库进行SELEX筛选，是生物体内小分子靶标Aptamer筛选方面直接应用的重要尝试。

    3.3?石英晶体微天平-SELEX（QCM-SELEX）

    石英晶体微天平是非常灵敏的质量检测仪器，测量精度可达ng级，理论上可以测到的质量变化相当于单分子层或原子层的几分之一。通过靶标与核酸的结合导致质量的变化引起的共振频率改变，可判断二者之间的亲和力，并以此为依据进行筛选。2018年，Hu等[80]首次报道了QCM-SELEX筛选丙烯酰胺（Acrylamide，AA，C3H5NO，71.08） Aptamer的方法。QCM晶体表面的羧基被激活后，与AA-BSA或BSA的氨基结合，用于筛选。经过14轮正向筛选和4轮反向筛选得到2条AA的Aptamer序列，KD分别为17.2 和115.2 nmol/L。该方法以质量改变为依据，实现了小分子靶标Aptamer的筛选，可对筛选过程实时观测，且无需对结合和游离的核酸分子进行分离，为克服小分子靶标Aptamer筛选的难点提出了新思路。但是，筛选轮次过多使得筛选效率下降，也是该方法需要克服的不足。

    3.4?计算机辅助-SELEX（In Silico SELEX）

    计算机技术辅助Aptamer筛选主要有3个方面的应用。最普遍的应用是利用mFold软件对靶标与Aptamer的作用位点进行预测，然后可对Aptamer的有效序列进行优化截短。如前文报道的STX、OA、CLB、妥布霉素和链霉素等的Aptamer序列都经过计算机辅助设计截短。其次，可以通过计算机模拟Aptamer序列的特定点位进行点突变，提升Aptamer的亲和力，实现核酸序列的修饰和优化。如Zheng等[3]在Handy等[2]报道的STX Aptamer基础进行修饰，亲和力提升了约30倍。仅有少数报道对Aptamer的三维图像进行了进一步的预测。目前，并没有可实现小分子Aptamer筛选的统一软件。刘书霞等[86]初步建立了小分子Aptamer計算机辅助筛选平台，可完成小分子Aptamer的筛选和结构预测及动力学研究。将计算机技术用于辅助Aptamer的筛选，对提高筛选效率以及Aptamer的修饰和结构优化具有指导作用，也可明显节省实验成本，提升筛选效率。

    4?总结与展望

    Aptamer在毒素、抗生素、激素等小分子检测方面有广泛的应用空间。利用Aptamer识别小分子靶标，建立基于传感技术的检测方法，有望实现实际样品中小分子的快速和灵敏检测。目前，具有良好应用效果的小分子的Aptamer数量远不能满足实际需要，小分子的Aptamer的高效筛选仍然有很大的发展空间。GO等新材料的使用有望提高SELEX的效率和Aptamer的亲和力，计算机辅助技术可优化和改造Aptamer的序列和结构。这些改进型SELEX技术的发展应用将为高效筛选小分子的Aptamer提供新方法和新思路。此外，深入理解小分子的Aptamer筛选的本质问题和SELEX过程存在的不足，建立小分子Aptamer的亲和力和特异性一致性评价标准，仍然是小分子Aptamer得以广泛应用的关键。

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