猪场排污口大肠杆菌耐氯霉素基因FLO的分子流行病学调查
宋丽娜
摘要：采用建立PCR的方法对实验室保存的135株规模化养猪场排污口的大肠杆菌进行了氯霉素耐药基因FLO的检测。结果显示135株大肠杆菌中氯霉素抗性基因FLO的检出率为 36.7 %，证实该耐药基因在猪场排污口普遍存在。
关键词：大肠杆菌；耐药基因FLO；分子流行病学；猪场排污口
中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）02-0007-01
大肠埃希菌是医学和兽医临床上最常见的一种病原菌，是人及动物的主要共生菌，其抗原性复杂，血清型多样，引起的临床症状和病理变化多样，且多与病毒性疾病和其他细菌性疾病并发，给人类及畜牧业的发展造成了严重的经济损失，严重危害畜禽及人类的健康，每年由大肠埃希菌病带来的经济损失数以亿计，所造成的危害十分严重。在医学上曾报道感染大肠埃希菌O157后的平均死亡率为1.5%，病程平均时间6.9周。据估计，全球每年因感染产毒素性大肠埃希菌至少可导致6.5亿人发病，并引起约80万5岁以下儿童死亡。我国不少地区大肠埃希菌在腹泻病人的病原谱中占首位。在兽医临床上大肠埃希菌造成的危害十分严重，一年四季均可致病，如仔猪的黄白痢、仔猪水肿病、禽大肠埃希菌病等，一直是困扰养殖业发展的常见病。本研究采用建立PCR的方法对实验室保存的135株规模化养猪场排污口的大肠杆菌进行了氯霉素耐药基因FLO的检测。旨在为大肠杆菌病的防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 本实验室保存的从猪场排污口采集的135株大肠杆菌菌株。
1.1.2 试剂 TaqDNA 聚合酶购自 MBI， dNTP 及 DNA Marker-DL2000 购自北京天根生物科技有限公司，引物购自 Generay Biotech 公司。普通琼脂平板及培养基由本实验室配制。常规试剂为分析纯。
1.1.3 仪器 PCR仪器（德国进口），凝胶电泳仪、紫外线成像系统（上海跃进医疗器械厂），CJ型超净工作台（苏州百神科技网络系统公司），高压蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂），电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），电炉、水浴箱、微量移液枪、玻棒、量筒、500 mL锥形瓶、酒精灯、EP管（0.5 μL和1.5 μL）等。
1.2 试验方法
1.2.1 模板的制备 在肠杆菌选择性培养基麦康凯琼脂平板上挑取单个典型红色菌落溶入盛有100 μL灭菌蒸馏水的EP管中，放入沸水中煮10 min后迅速转入-20 ℃环境下4 min，再于10 000 r/min离心1 min后放入4 ℃作模板备用。
1.2.2 PCR法扩增氯霉素抗性基因FLO 采用50 μL体系，包括10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 5 μL，上、下游引物各5 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL，模板 10 μL， 石蜡油 5 μL，灭菌蒸馏水补足至50 μL。按下列条件反应：95 ℃ 4 min，4 ℃ 50 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，4℃ 60 min。30个循环。上游引物序列：5′-CTGAGGGTGTCGTCATCTA-3′；下游引物序列： 5′-GCTCCGACAATGCTGACTAT-3′。
1.2.3 凝胶电泳试验 试验采用琼脂糖凝胶电泳。配制1%的琼脂糖凝胶供检测用， 于紫外灯下观察电泳结果并照相。
2 结果与分析
试验结果（图1）表明，猪场排污口大肠杆菌普遍存在氯霉素抗性基因FLO，检测的135株大肠杆菌中FLO 的检出率为36.7%。
3 小结与讨论
本试验结果表明，所检测的大肠埃希氏菌对氯霉素耐药的基因FLO检出率高达36.7%，说明氯霉素耐药基因FLO在猪场排污口流行很严重。虽然目前国际上已经禁止氯霉素的使用，但是猪场排污口还是检测出了耐氯霉素基因。究其原因，可能是在大肠埃希氏菌病的治疗中，氯霉素类抗革兰氏阴性菌的药物普遍被违规使用或有氯霉素相同成分的替代药物出现；其次，环境中存在有利于耐药性诱导及耐药基因转移的条件，导致耐药基因的普遍传播[1，2]。
猪场排污口作为猪场与外界环境的交接点，在排污口检测到耐药基因，说明以往养殖场里的生物发酵、化学药物的消毒等措施并不能阻止养殖场中大肠杆菌耐药基因的环境释放，而且对于很多猪场来说，排污之前并没有采取任何措施，这直接导致耐药基因在环境中水平传播，对以后的动物及人的临床用药增加了难度。
从研究结果来看，加强养殖场排污管理迫在眉睫，而且对于兽医临床用药也要规范合理化，已经禁用的氯霉素更应严格把关，不许违禁使用。
参考文献：
[1] 徐小艳，王国相，印继华，等.1975～2002年大肠杆菌耐药性变化情况调查[J].畜牧与兽医，2013，35（3）：29-32.
[2] 朱力军.动物性大肠杆菌耐药性的变化趋势[J].中国兽药杂志，2010，35（2）：16-18.
