黄曲霉毒素B1的检测方法
徐荣 张佩华
摘要：目前研究进展显示，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1简写为AFB1）是化学物质中致癌性最强的一种，对人和动物都会造成危害，本文旨在对黄曲霉毒素B1的毒性和检测方法进行综述。
关键词：黄曲霉毒素B1 毒性 检测方法
黄曲霉毒素B1主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是谷物污染中常见的具有强致癌性、致毒性、致畸性的真菌毒素，在生产中容易造成经济损失、影响人畜健康，所以黄曲霉毒素B1的检测方法在饲料生产和人类生活中具有重要意义。
1 黄曲霉毒素B1简介
AFB1是含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）的二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，是目前已知化学致癌性最强的物质之一.可以通过储存、加工等各种途径污染粮油等农产品、食品和饲料等，直接或间接危害人类和动物的健康。
2 黄曲霉毒素B1的毒性
黄曲霉毒素B1的毒性要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍。黄曲霉毒素B1的急性毒性是砒霜的68倍，氰化钾的10倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。
当人类大量摄人AFB1时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生;微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFB1具有致癌性，可导致人类肝癌和食道癌。
當动物家禽摄入AFB1时，采食量，体增重和饲料转化率均会降低;还会导致不孕、流产、肺水肿、疫病易感性增加等现象发生。
3 黄曲霉毒素B1的检测方法
世界各国及国际组织都制定了黄曲霉毒素B1的限量标准。GB 5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中规定当称取样品5g时，柱前衍生法AFB，的检出限为0.03μg/kg。目前，AFB1的检测方法有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、微柱筛选法、微柱快速法、近红外线分析仪测定法等。
3.1 薄层色谱法（TLC）
TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法，是中国测定食品及饲料中AFT黄曲霉素B1（AFBl）的标准方法之一（GB/T5009.23-2006）。其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将AFB1从样品中提取出来，经溶剂萃取纯化，再在薄层板上层析展开，分离，利用AFB1的荧光特性，根据荧光斑点的大小和强弱，比较测定黄曲霉毒素含量。
TLC有单项展开法和双向展开法，TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但由于该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想.提取液中杂质较多因而在展开时影响斑点的荧光强度，而双向展开虽避免了杂质干扰，增加了灵敏度，但增加了操作步骤和时间。
3.2 液相色谱法
叶雪珠等（2003）用高效液相色谱法对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别进行定量分析。其主要是用荧光检测器检测.在适宜的流动相条件下.采用反相C18柱，使多种黄曲霉毒素同时分离。黄曲霉毒素免疫亲和柱HPLC法采用单克隆抗体免疫技术，可以特效地将黄曲霉毒素与其他真菌素中分离出来，分离效率和同收率高。此方法已得到广泛应用，并被美国官方分析化学家协会（AOAC）确认为官方检测方法。该方法的检测限可达0.02—5ug/L。
郭金喜等（2017）研究结果表明，此方法影响测量AFB1结果不确定度的主要因素为样品称量、溶液体积、最小二乘法标准曲线拟合、样品同收率等。所以在测试过程中可以从减小主要不确定度的来源进行改进，进而降低测量不确定度，使测试的准确率提高。
3.3 酶联免疫法（ELISA）
酶联免疫法检测AFB1的理论基础是抗原抗体反应，其采用单克隆或多克隆抗体技术，具有特异性强、分析时间短等优点。其原理是抗原（或抗体）吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标抗体（或抗原）与标本中的待测物（抗原或抗体）起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大体分为两类：一是用双抗体夹心法检测样本中的AFTB1，二是用竞争法检测样本中的AFTB1。为了使用方便，目前国内外已研制了酶标记免疫吸附测定试剂盒及配套仪器，此方法也被列入国家标准（GB/T5009.22 1996第二法）。
但由于ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，因此ELISA法测定结果稳定性较差，分析结果的准确性不高，容易出现假阳性结果。
柳其芳（2006）研究表明酶联免疫吸附法是目前国际测定黄曲霉毒素B1的先进方法，灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速、操作安全。薄层色谱法中的确证试验是利用三氟醋酸和黄曲霉毒素B1的特异性反应所生产的衍生物，确证黄曲霉毒素B1。结合国际先进酶联免疫吸附法和传统方法的优点，科学地实现了快速、可靠、准确测定黄曲霉毒素B1的目的。
张俊（2013）也研究表示薄层色谱法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量有操作繁琐、使用化学试剂量大、对实验人员健康危害大、定量差、耗时长等缺点。张俊个人建议推广使用酶联免疫吸附法测定粮食及其制品中黄曲霉毒素B1含量。
3.4 液相色谱串联质谱法
一般来说，组织中黄曲霉毒素含量很低，而液相色谱串联质谱法具有比高效色谱法更高的灵敏度和准确性，如今这种方法还极少使用在测定组织霉菌毒素含量中。该方法检测限可达0.02～0.025 ug/L。84%甲醇水溶液提取样品中，正己烷脱脂，HLB固相萃取柱净化。采用电喷雾电离，正离子扫描，选择多反应检测模式（MRM）监测，外标法定量，该法灵敏，结果可靠。
甘盛等（2016）研究利用液相色谱一串联质谱法对软胶囊中药用油辅料内黄曲霉毒素B1含量进行测定，结果表明此法灵敏准确，专属性强，干扰少，重现性佳，对含油药物制剂中黄曲霉毒素B1含量检测有参考意义。
孙伟华等（2017）在基于分散固相萃取液相色谱一串联质谱法测定大米中8种真菌毒素试验中取得了成功并表示此方法实用、可靠，具有简单、经济、快速、准确等优点，可作为大米中真菌毒素的快速检测方法。
4 小结
黄曲霉毒素B1容易污染饲料，对人畜健康会造成严重危害，容易造成经济价值损失，目前各学者对黄曲毒素B1检测方法仍在不断研究，液相色谱法所需设备简单，相对传统，目前国内外仍在应用，但其存在耗时较长、操作繁琐、使用化学试剂量大、对实验人员健康危害大、定量差等不足之处;液相色谱法的准确率相对较高，目前也已广泛应用：酶联免疫法就目前来说比较先进，但是其也有缺点存在，比如酶的活性易受试验条件影响，结果稳定性差，但总的来说其优点多于缺点，所以不少学者开始推荐使用酶联免疫法测定黄曲霉毒素Bl在食品和饲料中的含量;液相色谱串联质谱法目前使用较少，但其灵敏度和准确度相对较高，近年来也有关于此方法的研究，笔者认为，此方法在以后也会被广泛推广应用。
总的来说，每种方法都有其优、缺点，在日常生产中具体使用什么方法还是得具体针对其当前条件做出选择。希望以后能找到更方便有效的检测方法，达到快速和准确监控饲料中的黄曲霉毒素含量。
参考文献（略）
摘要：目前研究进展显示，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1简写为AFB1）是化学物质中致癌性最强的一种，对人和动物都会造成危害，本文旨在对黄曲霉毒素B1的毒性和检测方法进行综述。
关键词：黄曲霉毒素B1 毒性 检测方法
黄曲霉毒素B1主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是谷物污染中常见的具有强致癌性、致毒性、致畸性的真菌毒素，在生产中容易造成经济损失、影响人畜健康，所以黄曲霉毒素B1的检测方法在饲料生产和人类生活中具有重要意义。
1 黄曲霉毒素B1简介
AFB1是含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）的二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，是目前已知化学致癌性最强的物质之一.可以通过储存、加工等各种途径污染粮油等农产品、食品和饲料等，直接或间接危害人类和动物的健康。
2 黄曲霉毒素B1的毒性
黄曲霉毒素B1的毒性要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍。黄曲霉毒素B1的急性毒性是砒霜的68倍，氰化钾的10倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。
当人类大量摄人AFB1时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生;微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFB1具有致癌性，可导致人类肝癌和食道癌。
當动物家禽摄入AFB1时，采食量，体增重和饲料转化率均会降低;还会导致不孕、流产、肺水肿、疫病易感性增加等现象发生。
3 黄曲霉毒素B1的检测方法
世界各国及国际组织都制定了黄曲霉毒素B1的限量标准。GB 5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中规定当称取样品5g时，柱前衍生法AFB，的检出限为0.03μg/kg。目前，AFB1的检测方法有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、微柱筛选法、微柱快速法、近红外线分析仪测定法等。
3.1 薄层色谱法（TLC）
TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法，是中国测定食品及饲料中AFT黄曲霉素B1（AFBl）的标准方法之一（GB/T5009.23-2006）。其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将AFB1从样品中提取出来，经溶剂萃取纯化，再在薄层板上层析展开，分离，利用AFB1的荧光特性，根据荧光斑点的大小和强弱，比较测定黄曲霉毒素含量。
TLC有单项展开法和双向展开法，TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但由于该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想.提取液中杂质较多因而在展开时影响斑点的荧光强度，而双向展开虽避免了杂质干扰，增加了灵敏度，但增加了操作步骤和时间。
3.2 液相色谱法
叶雪珠等（2003）用高效液相色谱法对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别进行定量分析。其主要是用荧光检测器检测.在适宜的流动相条件下.采用反相C18柱，使多种黄曲霉毒素同时分离。黄曲霉毒素免疫亲和柱HPLC法采用单克隆抗体免疫技术，可以特效地将黄曲霉毒素与其他真菌素中分离出来，分离效率和同收率高。此方法已得到广泛应用，并被美国官方分析化学家协会（AOAC）确认为官方检测方法。该方法的检测限可达0.02—5ug/L。
郭金喜等（2017）研究结果表明，此方法影响测量AFB1结果不确定度的主要因素为样品称量、溶液体积、最小二乘法标准曲线拟合、样品同收率等。所以在测试过程中可以从减小主要不确定度的来源进行改进，进而降低测量不确定度，使测试的准确率提高。
3.3 酶联免疫法（ELISA）
酶联免疫法检测AFB1的理论基础是抗原抗体反应，其采用单克隆或多克隆抗体技术，具有特异性强、分析时间短等优点。其原理是抗原（或抗体）吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标抗体（或抗原）与标本中的待测物（抗原或抗体）起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大体分为两类：一是用双抗体夹心法检测样本中的AFTB1，二是用竞争法检测样本中的AFTB1。为了使用方便，目前国内外已研制了酶标记免疫吸附测定试剂盒及配套仪器，此方法也被列入国家标准（GB/T5009.22 1996第二法）。
但由于ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，因此ELISA法测定结果稳定性较差，分析结果的准确性不高，容易出现假阳性结果。
柳其芳（2006）研究表明酶联免疫吸附法是目前国际测定黄曲霉毒素B1的先进方法，灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速、操作安全。薄层色谱法中的确证试验是利用三氟醋酸和黄曲霉毒素B1的特异性反应所生产的衍生物，确证黄曲霉毒素B1。结合国际先进酶联免疫吸附法和传统方法的优点，科学地实现了快速、可靠、准确测定黄曲霉毒素B1的目的。
张俊（2013）也研究表示薄层色谱法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量有操作繁琐、使用化学试剂量大、对实验人员健康危害大、定量差、耗时长等缺点。张俊个人建议推广使用酶联免疫吸附法测定粮食及其制品中黄曲霉毒素B1含量。
3.4 液相色谱串联质谱法
一般来说，组织中黄曲霉毒素含量很低，而液相色谱串联质谱法具有比高效色谱法更高的灵敏度和准确性，如今这种方法还极少使用在测定组织霉菌毒素含量中。该方法检测限可达0.02～0.025 ug/L。84%甲醇水溶液提取样品中，正己烷脱脂，HLB固相萃取柱净化。采用电喷雾电离，正离子扫描，选择多反应检测模式（MRM）监测，外标法定量，该法灵敏，结果可靠。
甘盛等（2016）研究利用液相色谱一串联质谱法对软胶囊中药用油辅料内黄曲霉毒素B1含量进行测定，结果表明此法灵敏准确，专属性强，干扰少，重现性佳，对含油药物制剂中黄曲霉毒素B1含量检测有参考意义。
孙伟华等（2017）在基于分散固相萃取液相色谱一串联质谱法测定大米中8种真菌毒素试验中取得了成功并表示此方法实用、可靠，具有简单、经济、快速、准确等优点，可作为大米中真菌毒素的快速检测方法。
4 小结
黄曲霉毒素B1容易污染饲料，对人畜健康会造成严重危害，容易造成经济价值损失，目前各学者对黄曲毒素B1检测方法仍在不断研究，液相色谱法所需设备简单，相对传统，目前国内外仍在应用，但其存在耗时较长、操作繁琐、使用化学试剂量大、对实验人员健康危害大、定量差等不足之处;液相色谱法的准确率相对较高，目前也已广泛应用：酶联免疫法就目前来说比较先进，但是其也有缺点存在，比如酶的活性易受试验条件影响，结果稳定性差，但总的来说其优点多于缺点，所以不少学者开始推荐使用酶联免疫法测定黄曲霉毒素Bl在食品和饲料中的含量;液相色谱串联质谱法目前使用较少，但其灵敏度和准确度相对较高，近年来也有关于此方法的研究，笔者认为，此方法在以后也会被广泛推广应用。
总的来说，每种方法都有其优、缺点，在日常生产中具体使用什么方法还是得具体针对其当前条件做出选择。希望以后能找到更方便有效的检测方法，达到快速和准确监控饲料中的黄曲霉毒素含量。
参考文献（略）
