皮敏消胶囊的抗炎抗过敏作用机制研究

    丛林 周子力 冯涛 马志跃

    

    

    

    [关键词]皮敏消胶囊;抗炎;抗过敏;药理机制

    皮敏消胶囊属于中药制剂，能够发挥祛风除湿、清热解毒、凉血止痒、消肿散结等效果[1]，目前已经被证实具有治疗湿疹[2]、慢性荨麻疹[3-4]的作用，以及对多种皮肤疾病例如玫瑰糠疹[5-6]、银屑病[7-8]、皮肤瘙痒[9]等都有一定的功效，并且有研究表明，在临床疗效观察中，皮敏消胶囊具有抗炎、抗过敏作用，能显著降低患者的免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平，改善患者炎症状态，炎症因子降钙素原（Procalcitonin，PCT）、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平也显著下降[10]。尽管皮敏消胶囊的临床疗效已经被证实，但是关于皮敏消胶囊的药理作用机制研究目前仍为不足。本次主要对皮敏消胶囊的抗炎、抗过敏作用机制进行了研究。

    1 材料和方法

    1.1 试验药品：皮敏消胶囊（四川德峰药业有限公司，批号：180612）;醋酸地塞米松（浙江仙据制药股份有限公司，批号：1805088）;阿司匹林肠溶片（石药集团欧意药业有限公司生产，批号：180722）。

    1.2 试剂：伊文思蓝、INF-γ、IL-4Elisa试剂盒、醋酸、二甲苯、卵白蛋白、NOS分型试剂盒、丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒、TNF-α蛋白抗体。

    1.3 试验动物：昆明种普通级小鼠，雌雄兼用;SD清洁级大鼠，雌雄兼用。

    1.4 试验细胞：LO2人源正常细胞。

    1.5 仪器：万分之一电子天平，低速自动离心机，超声细胞破碎仪，酶标仪，紫外分光光度计，超低温冰箱。

    1.6 实验方法

    1.6.1 急性毒性试验：取昆明种健康小鼠10只，雌雄各半，以梯度浓度方式给药10g/kg、25g/kg、50g/kg、100g/kg、200g/kg，每个浓度雌雄各一只，以灌胃方式给药，连续观察14d，详细记录动物反应情况。

    1.6.2 对小鼠耳廓肿胀的影响：取健康雄性小鼠，按体重随机分层为3组，每组3只，分别给予药物10g/kg、5g/kg、2.5g/kg作为试验组，以阿司匹林肠溶片（0.5g/kg）作为阳性对照组，以蒸馏水作为阴性对照组。各组灌胃给药3d，1次/d。末次给药后20min于小鼠右耳涂抹50μl二甲苯，10min后处死小鼠，沿耳廓边缘剪下左右两耳，用内径6.5mm的打孔器打下相同部位的左右二耳，称重并以两耳重量差为肿胀度。肿胀抑制率=（阴性对照组小鼠耳廓肿胀度-阳性对照组小鼠耳廓肿胀度）/阴性对照组小鼠耳廓肿胀度×100%。

    1.6.3 对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响：取健康雄性小鼠，随机分为3组，即皮敏消组（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、蒸馏水组、阿司匹林组，各组灌胃给药3d，1次/d。末次给药后在各组小鼠尾处静脉注射1%伊文思兰溶液，注射量为0.1ml/10g，同时腹腔注射0.5%醋酸溶液0.1ml/只，于注射醋酸溶液后30min处死小鼠，用20ml生理盐水冲洗腹腔，收集洗液，2 000r/min，离心10min，吸取上清液于590nm处测定吸光度值，以吸光度值反映小鼠腹腔毛细血管通透性的改变。

    1.6.4 对大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影响：取大鼠30只，随机分成3组，即蒸馏水组、皮敏消胶囊组（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、阿司匹林组，每组10只。以生理盐水配制Al（OH）3悬液（10g/L），阴性对照组每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各组大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白与Al（OH）3悬液（1ml）的混合液进行初次免疫，第10天重复1次。从初次免疫后第6天开始给药或蒸馏水，共9d，每日1次。末次给药后30min，在大鼠在未处死前于腹腔主动脉处取血，室温静置1h，待血清析出后，3 500r离心10min，取血清，分装后-20℃冰箱冻存待行ELISA检测。采用大鼠IFN-γ、IL-4酶联免疫试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，测定血清中IFN-γ、IL-4的吸光度，根据标准曲线，计算浓度。并比较IFN-γ/IL-4的变化。

    1.6.5 皮敏消胶囊对模型动物NO/NOS通路的影响：取9只大鼠，随机分组，每组3只。以生理盐水配制Al（OH）3悬液（10g/L），阴性对照组每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各组大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白与Al（OH）3悬液（1ml）的混合液进行初次免疫，第10天重复1次。从初次免疫后第6天开始，分别给予蒸馏水、皮敏消（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、地塞米松（5mg/kg），共给药9d，每日1次，收集炎症渗出液，按NOS分型试剂盒说明，测定渗出液中NOS、iNOS、NO含量。

    1.6.6 肝炎模型的制备及小鼠血浆丙氨酸转移酶活力的测定：每天2次连续7d灌胃给予皮敏消胶囊水溶液分为低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）剂量三组，对照组给予蒸馏水，环饱菌素35mg/kg每隔2d腹腔注射。P.acnes负荷于灌胃给药第3天开始。给药第7天灌胃后30min尾静脉注射后注射5μg/kg LPS-PBS溶液。小鼠在LPS注射8h后，在乙醚麻醉下心臟取血，置于肝素处理后的离心管中，3 000r/min离心10min，回收上清液储存在-20℃用于分析。小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶活性通过赖氏法检测试剂盒测定。测定原理利用在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及α-戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应30min后，加入2，4一二硝基苯磷盐酸溶液，终止反应后492nm下测定OD值。

    1.6.7 细胞毒性试验：将皮敏消溶解于DMSO中，以高剂量（200mg/ml）、中剂量（100mg/ml）、低剂量组（25mg/ml）对照三个组给药LO2人源正常细胞于96孔板中，每孔LO2正常细胞3 000个，分别培养24、48、72h，加入MTT溶液后培养4h，弃去上清，加入DMSO溶解结晶紫后，于492nm下测定OD值，计算细胞生存率。

    1.6.8 皮敏消对小鼠炎症模型中的血清TNF-α含量的影响：以生理盐水配制Al（OH）3悬液（10g/L），正常对照组每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各组大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白与Al（OH）3悬液（1ml）的混合液进行初次免疫，第10天重复1次。从初次免疫后第6天开始，分别给予皮敏消（2.5g/kg、5g/kg、10g/kg），共给药9d，每日1次并同样给药，3 500r/min离心10min，取血清，分装后-20℃冰箱冻存。后续操作按照Western blot操作进行测定。

    1.7 统计学分析：统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据的统计分析，计量资料用（x?±s）表示，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 急性毒性试验：试验发现，共有1只动物死亡，出现在观察期第2天，死亡率10%（1/10）。解剖发现，胃内充满药液，肠内也可见。其余部分动物出现精神萎靡，蜷缩等现象。其中，200g/kg、100g/kg试验组均无其他不适，因此认为该药物灌胃给药安全性高。

    2.2 对小鼠因二甲苯所致的耳廓肿胀的影响：2.5g/kg皮敏消胶囊组、5g/kg皮敏消胶囊组、10g/kg皮敏消胶囊组及阿司匹林組小鼠的耳廓肿胀程度均低于蒸馏水组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

    2.3 对小鼠腹腔毛细管通透性增高的影响：5g/kg皮敏消胶囊组和10g/kg皮敏消胶囊组小鼠的腹腔洗出液的吸光度值均低于蒸馏水组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

    2.4 对大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影响：2.5g/kg皮敏消胶囊组、5g/kg皮敏消胶囊组、10g/kg皮敏消胶囊组及阿司匹林组的IL-4含量均低于蒸馏水组，而INF-γ和INF-γ/IL-4比值均高于蒸馏水组，差异具有统计学意义（P <0.05），见表3。

    2 . 5 对NO/NOS通路的影响：2.5g/kg皮敏消胶囊组、5g/kg皮敏消胶囊组、10g/kg皮敏消胶囊组及地塞米松组的NOS、iNOS和NO含量均低于蒸馏水组，差异具有统计学意义（P <0.05），见表4。

    2.6 肝炎模型小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶活性：蒸馏水组小鼠血浆ALT（丙氨酸氨基转移酶）平均值为（24.28±3.47）IU/L，P.acnes-LPS负荷小鼠血浆平均值为（249.58±9.44）IU/L。P.acnes-LPS负荷小鼠血浆活性ALT显著升高，为肝损伤结果。与模型组相比，不同剂量皮敏消胶囊组血浆ALT水平显著降低。低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）剂量组小鼠血浆平均值分别为（178.44±3.69）IU/L、（148.47±6.99）IU/L及（134.79±9.96）IU/L。与模型组相比，皮敏消胶囊对小鼠血浆水平抑制率分别为21%、38%、47%，且呈一定量效关系。

    2.7 细胞毒性试验：高剂量（200mg/ml）、中剂量（100mg/ml）、低剂量组（25mg/ml）三个剂量组下细胞存活率都接近100%，即几乎无死细胞生成，无明显生长抑制作用，提示皮敏消胶囊对于人源正常肝细胞LO2无毒性作用。见图1（数据由Graphpad prism生成，图表平均值为三时间段平均值）。

    2.8 炎症小鼠血清中TNF-α的含量：由图2可知，皮敏消胶囊显著调低了炎症小鼠中TNF-α的表达量。

    3 讨论

    皮敏消胶囊属于中药制剂，主要成分包括：苍术、苦参、荆芥、防风、蜈蚣、白鲜皮、牡丹皮、蒲公英、地黄、黄岑、紫草、蝉蜕、地骨皮等21味中药;诸药合用能够发挥祛风除湿、清热解毒、凉血止痒、消肿散结等效果[1]，在临床上常常用于联合H1组胺抑制剂用于治疗慢性荨麻疹[4]，而对于湿疹也有一定作用[3]。

    本次研究中，探讨了皮敏消胶囊作为抗炎抗过敏药物的毒性，明确皮敏消胶囊的安全有效。验证了，皮敏消胶囊在二甲苯致小鼠右耳肿胀实验[11]中、在醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的实验中均显示了显著的作用。通过测定大鼠血清中INF-γ和IL-4的含量，确定了皮敏消胶囊通过调节T辅助淋巴细胞（Th）的细胞因子，影响INF-γ和IL-4的相对含量，从而发挥抗过敏作用[12]。NOS是一种含铁血红蛋白酶，与细胞色素还原酶类似，目前研究发现存在三种亚型，即诱生性（iNOS）、内皮型（eNOS）、神经型（nNOS）。其中，iNOS属于非钙依赖性酶，内毒素、IL-1、肿瘤坏死因子和干扰素-γ分泌时，可诱导巨噬细胞产生iNOS。iNOS可催化产生一氧化氮（NO）具有抗肿瘤、抗病原微生物等作用。然而iNOS的持续激活，又可以介导过量NO的产生，从而造成过强的免疫应答，导致炎症、变态反应的产生[10]。本研究表明，皮敏消胶囊也能够有效地降低NOS、iNOS以及下游的NO含量，从而发挥抗炎效应。本实验测定了肝炎模型小鼠中ALT[13]的活性，皮敏消显著的抑制了ALT的升高，一定程度上保护了由于P.acnes-LPS[14]诱导的肝炎细胞，说明皮敏消胶囊确实具有抗炎的功效。实验还测定了在LO2细胞[15]中测定了皮敏消胶囊的毒性，与预想一样，皮敏消胶囊并无细胞毒性。另外实验还通过Westernblot定性检测了炎症因子TNF-α[16-17]这个重要指标的含量，结果显示皮敏消胶囊可以显著降低TNF-α的含量，从而起到抗炎作用。

    在临床治疗中，皮敏消胶囊能够显著缓解荨麻疹、湿疹这类疾病，而对于一些并不典型的皮肤瘙痒、过敏等症状，也能够明显治疗，这与皮敏消胶囊能够发挥抗炎抗过敏作用有关。在临床治疗中，皮敏消胶囊一般用于与组胺受体抑制剂西替利嗪、特非那定等联合使用，但也有单独使用的案例。本研究明确了皮敏消胶囊的药理作用，从蛋白、细胞、动物三个不同层次水平上阐述了皮敏消胶囊的药理作用机制，确定了皮敏消胶囊的抗炎抗过敏活性，与很多天然化合物的广泛药理活性类似[18-19]，这也为将来皮敏消胶囊的更广泛的临床应用打下了基础。